肝细胞癌患者血清中CD31表达水平及其对肿瘤细胞侵袭及增殖的影响

周焕城，彭广福，宋越，张彩云，王捷

（1中山大学孙逸仙纪念医院肝胆外科，广东 广州 510000；2.广东省梅州市人民医院肝胆外科，广东 梅州 514000）

·论著·

肝细胞癌患者血清中CD31表达水平及其对肿瘤细胞侵袭及增殖的影响

周焕城1，彭广福2，宋越2，张彩云2，王捷1

（1中山大学孙逸仙纪念医院肝胆外科，广东 广州 510000；2.广东省梅州市人民医院肝胆外科，广东 梅州 514000）

目的探讨肝细胞癌（HCC）患者血清CD31表达水平以及对肝癌细胞侵袭和增殖影响。方法选取该院45例HCC患者为研究组，45例同期体检的健康人群为对照组，ELISA检测肝癌患者血清CD31表达水平；采用小分子干扰RNA（siRNA）抑制肝癌细胞中CD31的表达，transwell法观察CD31对肝癌细胞侵袭的影响，CCK-8（Cell Counting Kit-8）法检测肝癌细胞增殖的变化。结果CD31在肝癌患者血清中的表达水平显著高于正常健康人群，差异具有统计学意义（P＜0.05）；抑制肝癌细胞中CD31的表达后，肝癌细胞的侵袭和增殖能力显著下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论CD31在肝癌患者血清中高表达，并可增强肝癌细胞的侵袭和增殖能力。

CD31；肝细胞癌；侵袭；增殖

原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），简称肝癌，是恶性程度最高、最常见的肿瘤之一，具有进展快、治疗复杂及生存时间短等特点，目前仍以手术切除为主要治疗手段，国外学者研究报道肝癌5年生存率12%左右，而国内学者研究认为肝癌5年生存率约为32.5%[1-2]。目前为止，肝癌的发病机制尚未完全明确，越来越多的研究者关注肝癌细胞内基因表达对肝细胞癌的发生、发展及其转归的影响。

CD31又称为血小板-内皮细胞黏附分子（plateletendothelialcelladhesionmolecule-1，PECAM-1/CD31），最早发现于1990年[3]，分子量约为130 kDa，其结构属于免疫球蛋白超家族成员，近年来的研究表明CD31与动脉粥样硬化症、肺癌及卵巢癌[4-6]等多种疾病的发病机制有关，然而，CD31在肝细胞癌的发病机制中作用的报道尚少。本文旨在研究CD31在肝细胞癌患者血清中的表达，以及干扰肝癌细胞中CD31表达后，对肝癌细胞侵袭及增殖能力的影响，从而对于肝细胞癌的防治提供一定的理论基础。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2013年6月-2015年3月，本科室肝癌手术患者45例为研究组。男21例，女24例；年龄39～75岁，平均（51.67±7.37）岁。所有患者术前均未经介入或放化疗等治疗，均接受了肝癌根治性切除术，所有患者术后病理学证实为肝细胞癌，且未发现远处转移，排除合并其他慢性病如高血压、糖尿病，或其他肿瘤的患者。对照组为同期健康体检人群45例。其中，男20例，女25例；年龄37～78岁，平均（54.02±7.98）岁。

1.2 主要试剂

SMMC-7721细胞购自ATCC公司，DMEM培养基、胎牛血清（FBS）购自Gibco公司，荧光标记的2'-O-甲基siRNA CD31-FAM、稳定阴性对照siRNA CD31-NC和CD31引物购自上海吉玛生物技术有限公司，RNA提取试剂盒Trizol购于Gibco公司，Real-time PCR试剂盒购自Roche公司，抗CD31抗体购自Abcam公司，抗β-actin抗体购自Santa Cruz公司，羊抗兔二抗购自Santa Cruz公司，CCK-8购自上海博谷生物科技有限公司。

1.3 细胞培养

SMMC-7721细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，细胞生长至对数生长期时，以1×105个/平皿,接种于6 cm平皿，或以4×106个细胞/平皿,接种于10 cm平皿，孵育细胞。

1.4 细胞转染

采用脂质体2000（美国Invitrogen公司）对人肝癌细胞SMMC-7721中CD31 mRNA抑制表达，于48 h候检测其干扰效率。CD31 siRNA干扰序列：正向5'-UUCCGUUCUAGAGUAUCUG-3'，反向5'-CAGA UACUCUAGAACGGAA-3'。

1.5 检测指标

1.5.1 ELISA检测肝癌患者血清CD31表达水平取研究组和对照组患者外周血2 ml，静置6 h后，离心取上清，依照产品说明书，ELISA试剂检测两组CD31的表达水平。

1.5.2 Real-time PCR检测肝癌细胞中CD31mRNA表达水平将培养至对数生长期的肝癌细胞，用Trizol提取各组总RNA，反转录为cDNA，以作为GAPDH内参，依照产品说明书，测定TNF-α的变化。CD31引物序列正向：TCCAGGCCAGCTGCTCCACTT；反向：GCCTTCCGTTCTCTTGGTGAGGC。

1.5.3 Western blot检测肝癌细胞中CD31蛋白表达水平肝癌细胞培养至对数生长期，按照蛋白抽提步骤，提取总蛋白；采用BCA法测定总蛋白浓度，经SDS-PAGE电泳后转移到NC膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h，TBST洗涤后，分别加入1∶1 000抗CD31抗体、1∶500抗β-actin抗体，4℃孵育过夜，TBST洗涤后加入1∶5 000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，37℃孵育1 h，再用TBST洗涤，化学发光并曝光成像。Weastern blot检测以β-actin条带作为内参，CD31条带与其比较，观察CD31蛋白表达变化。

1.5.4 细胞迁移实验将处于对数生长期的肝癌细胞，调整细胞密度至4×l05个/ml，按0.1 ml/孔加入到transwell小室的上层，小室下层加入1 ml的含有10%血清的培养液。培养24 h后，对己迁移至小室下层的细胞进行计数（随机选取5个视野）。

1.5.5 细胞增殖实验将对数生长期的细胞以50%的汇合率接种至96孔板，每组设置3个复孔，同时设置不含细胞的空白培养基作为对照，37℃，5%二氧化碳CO2，95%湿度下培养24 h后，分别在培养孔加入10μl CCK-8溶液；再置于孵箱孵育2 h，酶标仪检测450 nm的吸光值，每孔实测OD值需减去空白对照OD值，取3复孔平均值，记录OD值。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 肝癌患者血清CD31表达水平

与建康人群相比，CD31在肝癌患者血清中的表达水平显著增高，差异有统计学意义（P＜0.001），提示CD31的高表达在肝癌的发生发展中可能发挥重要的调节功能（表1）。

附表 肝癌患者血清中CD31的表达水平

2.2 肝癌细胞转染siRNACD31后CD31表达变化

SMMC-7721肝癌细胞转染siRNA CD31后，同对照相比，CD31mRNA的表达水平明显下降（见图1A），CD31蛋白表达水平也明显降低（见图1B），差异均具有统计学意义，提示低表达CD31肝癌细胞构建成功。

图1 转染siRNA CD31后肝癌细胞中CD31表达变化

2.3 肝癌细胞中CD31对细胞侵袭功能的影响

SMMC-7721肝癌细胞转染siRNACD31后，同对照相比，transwell小室下层细胞数量显著减少（图2），差异具有统计学意义（P＜0.001），提示了CD31具有增强肝癌细胞侵袭能力。

图2 肝癌细胞中CD31对细胞侵袭功能的影响

2.4 肝癌细胞中CD31对细胞增殖的影响

SMMC-7721肝癌细胞转染siRNA CD31后，同对照相比，肝癌细胞增殖显著减少（图3），差异具有统计学意义（P＜0.001），提示了CD31具有增强肝癌细胞侵袭能力。

图3 肝癌细胞中CD31对细胞增殖的影响

3 讨论

肝癌是常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内，肝癌的发病率居恶性肿瘤的第5位，病死率居第3位，而且55%的肝癌患者分布于我国[7]。目前，肝癌的发病机制尚未明确，诊断和治疗仍是临床难题之一。近年来，研究学者认为基因调控在肝癌发病机制中起到重要作用，特别是对肝癌细胞的黏附、侵袭和增殖的影响[8]，所以，肝癌细胞特异性的基因调控靶点是肝癌的诊断和治疗的全新研究方向。

CD31/PECAM-1是血管内皮细胞特异性标志物，可以通过细胞间、细胞核细胞基质间的相互作用，参与多种信号转导和炎症反应。随着研究的深入，在肿瘤细胞表达CD31，在肿瘤的基因调控中发挥作用[9-10]。本研究检测肝癌患者血清CD31的表达水平明显高于正常健康人群，提示高表达CD31可能起到调控肝癌细胞中的信号途径[11]，从而影响肝癌的发生发展。这与DAROM等人[12]研究发现CD31/ PECAM-1在非何杰金氏胃淋巴瘤患者体内表达增高结果是一致的，从侧面支持了本研究。

小分子干扰RNA（small interference RNA，siRNA）正逐渐取代反义核苷酸技术，成为肿瘤基因疗法的理想工具[13]。研究表明，阳离子脂质体可有效地实现siRNA的靶向输送，2'-O-甲基修饰的siRNA可提高siRNA的稳定性[14]。本研究通过siRNA干扰抑制肝癌细胞中CD31的表达，用以研究CD31对肝癌细胞的影响。结果显示采用siRNA干扰抑制CD31的表达后，检测肝癌细胞中CD31的基因和蛋白表达水平均显著低于未受干扰的肝癌细胞，，说明低表达CD31肝癌细胞株构建成功。

肿瘤细胞的侵袭和增殖能力与肿瘤的转移和生长速度密切相关，影响着肿瘤的发展和转归[15-16]。本研究运用已构建成功的低表达CD31肝癌细胞与未受干扰抑制高表达CD31肝癌细胞相比，通过transwell实验发现高表达CD31肝癌细胞的侵袭能力显著强于低表达CD31肝癌细胞，说明CD31表达水平的高低影响着肝癌细胞的侵袭能力。此外，本研究运用CCK-8实验研究肝癌细胞增殖能力发现，高表达CD31肝癌细胞的增殖能力显著强于低表达CD31的肝癌细胞，说明CD31表达水平越高，肝癌细胞的增殖能力越强。CD31的表达水平影响肝癌细胞的侵袭和增殖能力，这与TACHEZY M等人在导管内乳头状黏液性肿瘤中的研究结果是一致的[17]。

综上所述，在肝癌患者血清中CD31的表达水平显著升高，而且抑制CD31的表达水平可能减弱肝癌细胞的侵袭和增殖能力，从而使肝癌生长速度减慢，侵袭能力下降，这为肝癌的诊断和治疗的新靶点提供了理论参考依据。

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Expression of CD31 in the serum of hepatocellular carcinoma patients and the effects of cancer cell migration and proliferation

Huan-cheng ZHOU1,Guang-fu PENG2,Yue SONG2,Cai-yun ZHANG2,Jie WANG1
(1.Department of Hepatobiliary Surgery,Sun Yet-sen Memorial Hospital of Zhongshan University, Guangzhou,Guangdong 510000,P.R.China;2.Department of Hepatobiliary Surgery,Meizhou People's Hospital,Meizhou,Guangdong 514000,P.R.China)

【Objective】To investigate the expression of CD31 in the serum of HCC patients and the effects of cancer cell migration and proliferation.【Methods】45 cases of HCC patients in our hospital as the study group,40 healthy volunteers were used as control group,we used ELISA to detect the expression of CD31 in the serum of HCC patients.Using small interfering RNA(siRNA)to inhibit the expression of CD31 in hepatocellular carcinoma,the level of cancer cell migration was observed by transwell and the level of cell proliferation was observed by CCK-8.【Results】the expression of CD31 in the serum of HCC patients was significantly higher than the control group,the difference was statistically significant(P＜0.05);After the expression of CD31 was suppressed in hepatocellular carcinoma,the levels of cancer cell migration and proliferation were significantly decreased,the difference was statistically significant(P＜0.05).【Conclusion】the expression of CD31 in the Serum of HCC patients is increased, and may elevate the levels of cancer cell migration and proliferation.

CD31;hepatocellular carcinoma;migration;proliferation

R735.7

A

1005-8982（2015）31-0005-05

2015-04-23

广东省自然科学基金博士启动项目（No：S2012040007235）

王捷，E-mail：fxd531sgr@126.com