miR375过表达下调Nit-1细胞中肌侵蛋白的表达*

夏华强，廖聆燕，周建萍，唐爱发

（1.湖南省株洲市中心医院生殖中心，湖南 株洲 412000；2.深圳大学第一附属医院，广东 深圳 518060）

·论著·

miR375过表达下调Nit-1细胞中肌侵蛋白的表达*

夏华强1，廖聆燕1，周建萍1，唐爱发2

（1.湖南省株洲市中心医院生殖中心，湖南 株洲 412000；2.深圳大学第一附属医院，广东 深圳 518060）

目的为研究miR375对肌侵蛋白（MTPN）表达的影响，探寻miR375在糖尿病中的作用。方法该研究用质粒pAAV-miR375转染Nit-1细胞48 h后，分别通过Real time RT-PCR和Northern Blot检测Nit-1细胞中miR375的表达，Western Blot检测Nit-1细胞中MTPN蛋白的表达。结果在转染pAAV-miR375的Nit-1细胞中miR375的表达明显升高，是转染空质粒pAAV-MCS和未转染的6倍。MTPN蛋白的表达与转染了空质粒pAAV-MCS和未转染的Nit-1细胞相比，明显下降。结论在Nit-1细胞中miR375过表达引起了MTPN蛋白表达下调，推测miR-375可能是通过调节MTPN基因的表达来调控胰岛素分泌的，从而影响体内血糖的浓度。

miR375；Myotrophin（MTPN）；Nit-1细胞

miR375是胰腺中特异表达的miRNA之一。POY等证明在β细胞中miR375的过度表达可以抑制由葡萄糖所诱发的胰岛素分泌；相反，内源性miR375被抑制后则可以促进胰岛素的分泌[1]。WIGARD等发现在斑马鱼中miR375被敲除后，胰岛细胞在胰腺中呈分散分布[2]。NATHAN等研究发现miR375的过表达引起了β细胞基因表达的重新激活，并且下调细胞的分化，认为miR375表达上调后有利于胰岛素生成细胞的形成[3]。生物信息分析显示肌侵蛋白（mytrophin，MTPN）是miR375的目的蛋白之一，通过MTPN调节β细胞胰岛素的分泌[4]。本研究用质粒pAAV-miR375转染Nit-1细胞来观察miR375对MTPN表达的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

质粒pAAV-miR375构建见文献[5]，Nit-1细胞购自美国ATCC，低糖DMEM培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，XbaⅠ、HindⅢ、T4 DNA连接酶和DNase I酶购自NEB公司，PCR Taq酶购自Fermentas公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒和质粒小抽试剂盒购自Takara公司，Trizol试剂和LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司，mirVanaTMqRT-PCR miRNA Detection Kit和mirVanaTMqRTPCR Primer Set for Normalization（U6）试剂盒购自Ambion公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染Nit-1细胞用含10%FBS的低糖DMEM培养基培养于5%二氧化碳CO2、37℃的恒温箱中，每3 d传代1次。在转染质粒前将细胞传入六孔板中，然后将pAAV-miR375用LipofectamineTM2000转染至Nit-1细胞，转染方法按说明书操作。

1.2.2 RealtimeRT-PCR检测Nit-1细胞中miR375的表达收集转染pAAV-miR375 48 h后的Nit-1细胞，用Trizol法提取总RNA，经DNase I处理。用mirVanaTMqRT-PCR miRNA Detection Kit和mir-VanaTMqRT-PCR Primer Set for Normalization（U6）做Real-time RT-PCR检测Nit-1细胞中miR375的表达，操作按说明书进行。

1.2.3 Northern blot检测Nit-1细胞中miR375的表达Nit-1细胞转染pAAV-miR375 48 h后收集细胞，用Trizol法提取总RNA，取20μg总RNA经12%尿素变性聚丙稀酰胺凝胶电泳，120 V约1.5 h。电泳结束后于半干电泳仪上以100 mA转膜2 h，紫外交联仪上用紫外交联125 mJ，80℃烘烤1 h。用32P-labeled LNA375作探针进行杂交，洗膜，放射自显影。检测转基因动物中成熟miR375的表达。

1.2.4 Western blot检测Nit-1细胞中MTPN的表达Nit-1细胞转染pAAV-miR375 48 h后收集细胞，抽提蛋白做Western blot。取相同量的蛋白10%的聚丙稀酰胺电泳，半干转到PVD膜中一抗anti-myotrophin antibody（1∶300 B&D，USA）4℃孵育过夜，含0.1%x-triton的PBS洗5次，二抗Goat anti-mouse IgG（200μg/ml）（1∶10 000 Sigma）4℃孵育4 h，含0.1%x-triton的PBS洗5次，显影、曝光。

2 结果

2.1 RealtimeRT-PCR检测Nit-1细胞中miR375的表达

用pAAV-miR375转染Nit-1细胞48 h后，Trizol法提取Nit-1细胞的总RNA，经DnaseI酶处理，定量RT-PCR检测Nit-1细胞中miR375的表达。结果表明，在转染pAAV-miR375 48 h后的Nit-1细胞中miR375的表达是转染空质粒pAAV-MCS和未转染的6倍。Real-time RT-PCR检测Nit-1细胞中miR375的表达（见图1）。

图1 Real-time RT-PCR检测Nit-1细胞中miR375的表达

2.2 Northern blot检测Nit-1细胞中miR375的表达

用pAAV-miR375转染Nit-1细胞48 h后，Trizol法提取Nit-1细胞RNA，取20μg总RNA做Northern blot。结果显示，在转染质粒48 h后的Nit-1细胞中检测到miR375的表达比转pAAV-MCS质粒和未转染的明显升高。Northern blot检测Nit-1细胞中miR375的表达（见图2）。

图2 Northern blot检测Nit-1细胞中miR375的表达

2.3 Western blot检测Nit-1细胞中MTPN的表达

Nit-1细胞转染pAAV-miR375 48 h后收集细胞，抽提蛋白做Western blot检测Nit-1细胞中MTPN的表达。结果显示，在转染质粒48 h后的Nit-1细胞中MTPN的表达明显下调，而在转pAAV-MCS质粒和未转染的Nit-1细胞中MTPN的表达无变化。Western Blot检测Nit-1细胞中MTPN的表达（见图3）。

图3 Western Blot检测Nit-1细胞中Myotrophin（MTPN）蛋白的表达

3 讨论

miR375在糖尿病的发生、发展和治疗过程中起重要的作用，HIGUCHI和ZHU的研究都发现miR375是II型糖尿病的一个新的生物标记[6-7]。II型糖尿病患者血清中miR375的水平和启动子的甲基化都有明显的不同[8-9]。

鉴于miR375的重要作用，为解决糖尿病治疗中细胞移植缺乏细胞来源的问题，很多研究者用miR375诱导非β细胞成为分泌胰岛素的细胞。SHAER等用人miR375转染胎盘的基蜕膜间充质干细胞，4和6 d后real-time PCR检测发现胰腺发育相关基因Ins、Ngn3、GLUT2、PAX4、PAX6、KIR6. 2、NKX6.1、PDX1及glucagon表达，转染6 d后用免疫化学法检测发现Ins和Ngn3的蛋白表达。他们认为通过转染miR375，间充质干细胞能成为生成胰岛素的细胞[10]。SHAER A等用人miR375和人miR186共同转染诱导的多能干细胞，转染24和48 h后real-time PCR检测发现胰腺发育相关基因Ins、Ngn3、GLUT2、PAX4、PAX6、KIR6.2、NKX6.1、PDX1及glucagon表达。转染第3天，用免疫细胞化学法检测发现Ins和Ngn3的蛋白表达。他们认为通过转染人miR375和人miR186，诱导多能干细胞能成为生成胰岛素的细胞[11]。用Sox2、Klf4、cMyc和Oct4转入人皮肤成纤维细胞诱导成多能干细胞，然后转入miR375成功将多能干细胞诱导成分泌胰岛素的细胞[12]。

生物信息分析显示Mytrophin（MTPN）是miR375的目的蛋白之一。该研究结果发现，在与转染了空质粒和未转染的Nit-1细胞相比，转染pAAV-miR375的Nit-1细胞中miR375的表达升高6倍，MTPN蛋白的表达明显下降。这说明在Nit-1细胞中miR375过表达引起了MTPN蛋白表达下调。

miR-375是通过以下方式调节胰岛素的分泌，正常情况下MTPN与抑制F-actin表达的Capz蛋白相结合，F-actin正常表达。当miR-375高表达时成熟的miR-375与MTPN 3未翻译区结合从而降低了MTPN蛋白的表达，与MTPN相结合的Capz蛋白游离出来抑制F-actin表达，F-actin的网络结构发生改变，actin网孔出现重排，大量的胰岛素分泌颗粒不能排出细胞外[13]。相反，当miR-375表达降低时，大量的胰岛素分泌颗粒排出细胞外。另外MTPN/ V-1与IκBα蛋白具有非常相似的结构，作为一个转录因子激活NF-κB。在细胞中NF-κB的激活可以改善细胞骨架结构，提高葡萄糖刺激的胰岛素分泌。相反，NF-κB的活性降低时会抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌[14]。推测miR-375可能是通过MTPN基因来调控胰岛素分泌的，这可能成为糖尿病治疗中的一个新方向。

[1]POY MN,ELIASSON L,KRUTZFELDT J,et al.A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion[J].Nature,2004, 432(7014):226-230.

[2]WIGARD PK,ANNE KL,RENE FK,et,al.Targeted inhibition ofmiRNAmaturationwithmorpholinosrevealsarolefor miR-375 in pancreatic islet development[J].PLoS BIOLOGY, 2007,5(8):1738-1749.

[3]NATHAN GL,KREDO-RUSSO S,GEIGER T,et al.MiR-375 promotes redifferentiation of adult human β cells expanded in vitro[J].PLoS One,2015,10(4):e0122108.

[4]MATTHEW N POY,JEAN H,MIRKO TKI,et al.MiR-375 maintains normal pancreatic α-and β-cell mass[J].PNAS, 2009,106(14):5813-5818.

[5]夏华强,潘艺,刘律君,等.miRNA375表达质粒的构建及表达研究[J].中国现代医学杂志,2010,22(5):652-655.

[6]HIGUCHI C,NAKATSUKA A,EGUCHI J,et al.Identification of circulating miR-101,miR-375 and miR-802 as biomarkers for type 2 diabetes[J].Metabolism,2015,64(4):489-497.

[7]ZHU H,LEUNG SW.Identification of microRNA biomarkers in type 2 diabetes:a meta-analysis of controlled profiling studies[J]. Diabetologia,2015,58(5):900-911.

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[10]SHAER A,AZARPIRA N,VAHDATI A,et al.MiR-375 induces human decidua basalis-derived stromal cells to becomeinsulin-producing cells[J].Cell Mol Biol Lett,2014,19(3): 483-499.

[11]SHAER A,AZARPIRA N,KARIMI MH,et al.Differentiation of human induced pluripotent stem cells into insulin-like cell clusters with miR-186 and miR-375 by using chemical transfection[J].Appl Biochem Biotechnol,2014,174(1):242-258.

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[14]NORLIN S,AHLGRE U,EDLUND H.Nuclear factor-{kappa}B activity in{beta}-cells is required for glucose-stimulated Insulin secretion[J].Diabetes,2005,54(1):125-132.

Over-expression of miR-375 reduces MTPN in Nit-1 Cells*

Hua-qiang XIA1,Ling-yan LIAO1,Jian-ping ZHOU1,Ai-fa TANG2
(1.Department of Reproduction Center,Zhuzhou Central Hospital,Zhuzhou,Hunan 412000,P.R. China;2.The First Hospital of ShenZhen University,Shenzhen,Guangdong 518060,P.R.China)

【Objective】To study the effect on the expression of Myotrophin(MTPN)and finding the function of miR375 in diabetes.【Methods】48 hour after the pAAV-miR375 plasmid transfected into the Nit-1 cells,the expression of miR375 in the Nit-1 cells was analyzed by Real-time PCR and Northern Blot.The protein expression of MTPN in the Nit-1 cells was analyzed by western Blot.【Results】The expression of miR375 was increase 6 times in the Nit-1 cells transfected with pAAV-miR375,camper to the Nit-1 cells transfected with control plasmid or untransfected.The expression of MTPN was reduced apparently in the Nit-1 cells transfected with pAAV-miR375, camper to the Nit-1 cells transfected with control plasmid or untransfected.【Conclusion】Over-expression of miR-375 reduced the expression of Mtpn in Nit-1 cells in vitro,adjusting the blood glucose.

miR375;Myotrophin(MTPN);Nit-1 cells

R587.1

A

1005-8982（2015）31-0001-04

2015-06-12

国家自然科学基金（No：81270740）、湖南省卫生计生委2015年度科研计划课题项目（No：B2015-159）、株洲市年度医疗卫生领域指导性计划（No：2014YW01）

夏华强，E-mail：56338895@qq.com，Tel：0731-28561175