刘丹,吴玉环,沈洋,潘少安,张露军,曹林,马丽,郦枫,章艺,徐根娣,刘鹏*
1. 浙江师范大学生态研究所,浙江 金华 321004;2. 浙江师范大学植物学实验室,浙江 金华 321004;3. 杭州师范大学生命与环境科学学院,浙江 杭州 330036;4. 杭州旅游职业学院,浙江 杭州 311231
外源脱落酸对连作障碍下栝楼抗氧化酶系的影响
刘丹1,2,吴玉环3,沈洋1,潘少安1,张露军1,曹林2,马丽2,郦枫1,章艺4,徐根娣1,2,刘鹏1,2*
1. 浙江师范大学生态研究所,浙江 金华 321004;2. 浙江师范大学植物学实验室,浙江 金华 321004;3. 杭州师范大学生命与环境科学学院,浙江 杭州 330036;4. 杭州旅游职业学院,浙江 杭州 311231
在金华地区选取连作3年的栝楼(Trichosanthes kirilowii Maxim.)为试验材料,通过浇灌不同浓度(0,2.5,5,7.5,10 mg·L-1)脱落酸(ABA),在正常连作情况下测量其叶片的抗氧化酶系活性,探究外源脱落酸缓解栝楼连作障碍的作用机制,为缓解栝楼连作障碍提供理论依据。结果表明:在正常连作情况下,栝楼幼苗经过外源ABA连续处理7 d,处理结束后再过7 d对叶片进行采样测定酶活性,发现超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化物酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性总体随处理的外源ABA浓度的升高而呈现先增强后减弱的趋势。除了 PPO酶活性的峰值出现在外源ABA浓度为7.5 mg·L-1外,其余酶的酶活性峰值均出现在5 mg·L-1。在过高的外源ABA浓度下,SOD、POD、CAT的酶活性出现低于对照组的现象,推测过高浓度的外源ABA可能不利于连作植物生长。由隶属函数分析得出,5 mg·L-1的外源ABA可以有效缓解栝楼的连作障碍。
连作障碍;栝楼;脱落酸;抗氧化酶系
LIU Dan, WU Yuhuan, SHEN Yang, PAN Shaoan, ZHANG Lujun, CAO Lin, MA Li, LI Feng, ZHANG Yi, XU Gendi, LIU Peng. Effect of Exogenous Abscisic Acid on Anti-oxidative Enzymes of Replanted Trichosanthes kirilowii Maxim. [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(12): 1989-1994.
栝楼(Trichosanthes kirilowii Maxim.)也称瓜萎、吊瓜,属葫芦科,多年生攀缘草本植物。其根(中药名天花粉)、果(中药名栝楼实)、种子(中药名栝楼仁)、果皮(中药名栝楼皮)均可入药,具有扩张冠状动脉、抗肿瘤、抗溃疡、抗衰老、抑制血小板凝集等作用(任静等,2010)。近年来,有关栝楼的研究主要侧重于其化学组分(李爱峰,2014)、组织培养(钱骅等,2014)、蛋白提取工艺(熊利芝等,2014)、抗寒性(卢富桃等,2014)、繁殖(杨丽娜等,2008)以及耐铝性等方面(周媛等,2012),对栝楼连作障碍的研究目前还没有报道。连作障碍是指在同一片土壤中连续种植同一种作物或者近缘作物时,即使在正常的栽培管理条件下,也会出现生长变弱、产量降低、品质下降的现象。连作障碍不仅直接影响农产品的产量和品质,而且还会影响相关的加工业等。同时,田间滥用化肥农药的做法不但不能缓解连作障碍,反而会引起土壤质量下降,使得作物的产量和品质进一步降低,形成恶性循环。连作造成的土壤生物退化现象已经成为限制现代农业发展的重要因素(王玲娜,2010)。
脱落酸(Abscisic Acid),最开始作为一种调节植物生长发育的激素被人们所熟知。随着人们对它的研究不断深入,发现其不但可以平衡植物内源激素和有关生长活性物质的代谢,还可以有效激活植物体内抗逆免疫系统,增强植物综合抗性(抗旱、抗寒。抗热、抗盐碱等)的能力,因此,被人们称为“胁迫激素”和“生长平衡因子”(韩超等,2012)。目前为止,对脱落酸的研究方向主要有抗寒性(罗立津等,2011)、信号转导(吴玲云等,2014)、镉胁迫(张超,2014)等,国内外有关栝楼连作障碍的研究工作未见任何报道,更没有涉及到 ABA与缓解连作障碍之间关系的研究工作的相关报道。本文以连作3年的栝楼为试验材料,研究在常温下经过不同浓度的ABA处理,栝楼叶片内抗氧化酶系的变化,来探讨ABA与栝楼连作障碍的关系,为缓解栝楼连作障碍提供理论依据。
1.1供试验材料及处理方法
试验于2014年8月─2015年2月在浙江师范大学生物园进行,以植物基地内连续种植至第3年的栝楼为试验材料。选取生长状况一致的,光照条件均等的栝楼成苗,进行试验。
将实验材料进行分组:T0组,正常情况下连作3年生长的植株,每天浇灌蒸馏水于其根部,即对照组;T1组,浇灌2.5 mg·L-1ABA于其根部处理;T2组,浇灌5 mg·L-1ABA于其根部处理;T3组,浇灌7.5 mg·L-1ABA于其根部处理;T4组,浇灌10 mg·L-1ABA于其根部处理。各组在植株开花前连续浇灌ABA1周,每天每株500 mL,每组3株,浇灌结束7 d后采取新叶进行指标测定,每个处理3个重复,并进行数据分析处理。
1.2测定方法
抗氧化酶系的测定:超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定参照高俊凤(邹琦,2000)的方法;多酚氧化酶(PPO)参照紫外分光光度计(中国科学院上海植物生理研究所和上海市植物生理学会,1999)的方法。
1.3数据处理
数据处理根据3次独立试验所得,所有试验数据采用SPSS 18.0软件计算平均值和标准误差,分析差异显著性,origin 8.0软件制图。
利用模糊数学隶属函数法进行综合评估,具体方法为:
(1)式、(2)式表示i处理水平下j指标的缓解连作障碍的隶属函数值,Xij表示i处理水平下 j指标的测定值,Xjmax、Xjmin表示该处理水平下所测指标的最大值和最小值。在计算各生理指标的连作障碍系数的隶属函数值时,如果缓解连作障碍系数与连作障碍呈正相关,则用(1)式计算;如果连作障碍系数与连作障碍呈负相关,则用(2)式计算;(3)式表示在i水平下缓解连作障碍隶属函数的平均值。
2.1外源脱落酸对连作障碍下栝楼 SOD活性的影响
由图1可见,连续种植至第3年的栝楼经过不同浓度的ABA处理,不同的处理组间,SOD的活性存在显著性差异,可能与外源ABA和SOD的合成有着直接关系,外源ABA浓度的变化显著地影响着SOD的酶活性。T1、T2、T3处理组比T0分别提高了30.06%,161.6%,125.28%,而T4则比T0降低了67.96%。说明随着ABA浓度的增加,SOD活性出现先增强后减弱的现象,推测当外源 ABA的浓度超出一定范围后,会更加抑制SOD的活性,可能比植株连作障碍所造成的抑制程度更大,以致植株更容易受到外界的伤害。本实验 SOD活性在ABA浓度为5 mg·L-1时,出现最高值;当浓度为7.5 mg·L-1时,外源ABA仍可以提高SOD活性,只是效果不及浓度为 5 mg·L-1时。上述情况表明外源ABA与SOD活性变化存在一定关系,本研究为今后探明外源ABA与SOD活性之间的关系奠定基础。
图1 不同浓度外源ABA处理对连作障碍下栝楼SOD活性的影响Fig. 1 Effect on SOD activity of Trichosanthes kirilowii different concentrations of exogenous ABA under the continuous cropping obstacles
2.2外源脱落酸对连作障碍下栝楼 POD活性的影响
过氧化物酶(peroxidase,POD)对植物的呼吸作用和光合作用都起到一定的保护作用,可清除体内活性氧(Zhang et al.,2003)。由图2可知,不同浓度ABA对连作障碍下栝楼的POD活性,在个别处理组间存在显著性差异。处理组T1、T2比处理组T0分别提高了59.34%,126.04%,而T3、T4比处理组T0分别降低了38.57%,51.55%。表明随着ABA浓度的升高,POD活性呈现明显的先增强后减弱的现象,峰值出现在ABA浓度为5 mg·L-1时,但当浓度过高时,外源ABA不但没有缓解连作障碍,反而抑制了POD的活性。据此我们推测,在ABA浓度超过5 mg·L-1时,植株的POD活性呈现急速下降的趋势,说明此时栝楼叶片的抗氧化酶系受到损伤,活性氧的产生超出了系统的清除能力导致其大量积累而引起生物膜结构和功能的损伤。对照组与外源ABA为浓度7.5 mg·L-1、10 mg·L-1时的处理组,没有出现显著的差异。表明了外源ABA只有在一定浓度范围内,才能有效地调节 POD的活性,防止细胞质膜被过氧化物伤害。
图2 不同浓度外源ABA处理对连作障碍下栝楼POD活性的影响Fig. 2 Effect on POD activity of Trichosanthes kirilowii in different concentrations of exogenous ABA under the continuous cropping obstacles
2.3外源脱落酸对连作障碍下栝楼 PPO活性的影响
多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)在植物中以潜伏形式存在,当植物受到机械损伤或者病菌侵染后,PPO能迅速活化催化酚与O2发生氧化反应形成醌,导致组织发生褐变,以防止或减轻感染,提高其抗病能力(张建光等,2008)。有研究表明,有些果实(比如香蕉、荔枝等)的褐变主要由PPO催化的酶促褐变所导致(林河通等,2005)。栝楼连作至第3年,植株果实上开始出现褐色斑点,目前有待进一步研究证实 PPO酶与栝楼连作障碍之间的关系。由图 3可知,连作栝楼在不同浓度ABA处理下,PPO活性的变化在处理组间存在显著性差异,处理组T1、T2、T3、T4比T0分别提高了 106.11%,280.92%,347.33%,208.4%。随ABA浓度的升高,PPO活性呈现先增强后减弱的现象,在ABA浓度为7.5 mg·L-1时达到最大值。由此可猜测,最初低浓度的ABA有效地激活了PPO酶,使PPO催化形成醌的反应保护细胞。且在一定范围内,随着ABA浓度的升高,PPO浓度也逐渐升高,使植株生成较多的褐色斑点。当ABA浓度达到10 mg·L-1时,PPO浓度出现了降低现象,可能与PPO“自杀性抑制”有关(Chazarra et al.,1997)。然而,随着PPO的活性越高,植株生成的褐色斑点也越多,与栝楼连作障碍出现褐色斑点的症状相似,栝楼连作障碍的出现是否与PPO活性之间存在一定的联系,还有待进一步的研究。
图3 不同浓度外源ABA处理对连作障碍下栝楼PPO活性的影响Fig. 3 Effect on PPO activity of Trichosanthes kirilowii in different concentrations of exogenous ABA under the continuous cropping obstacles
图4 不同浓度外源ABA处理对连作障碍下栝楼CAT活性的影响Fig. 4 Effect on CAT activity of Trichosanthes kirilowii in different concentrations of exogenous ABA under the continuous cropping obstacles
2.4外源脱落酸对连作障碍下栝楼 CAT活性的影响
植物在进化过程中主要逐渐形成了消除活性氧的抗氧化酶系与非酶促系统,其中CAT和H2O2具有较高的亲和力,主要清除线粒体电子传递、脂肪酸氧化中产生的 H2O2,CAT含量的变化也是H2O2在体内变化的一种标志性反应(陈金峰等,2008)。由图4可见,不同浓度的ABA对连作栝楼的CAT活性的影响,在部分处理组之间存在显著性差异,处理组 T1、T2、T3比 T0分别提高了211.95%,260.67%,134.12%。随着ABA浓度的升高CAT活性呈现明显的先增强后减弱的趋势,并在浓度为5 mg·L-1时达到最大值。表明CAT的活性对于外源ABA浓度的变化是很敏感的,外源ABA浓度为10 mg·L-1时与对照组没有显著差异,说明高浓度的外源ABA无法缓解植株的连作障碍,反而会抑制酶活性,给植物生长带来不利的影响。
2.5外源脱落酸对连作障碍下栝楼 PAL活性的影响
苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase,PAL)是连接生物初级代谢和苯丙烷类代谢第一步反应的酶(李云萍等,2010),主要参与植物抗病、抗虫害、抗逆境的反应。由图 5可见,不同浓度ABA处理连作栝楼,PAL活性在个别处理组间出现显著性差异。处理组T1、T2、T3、T4比T0分别提高了51.85%,164.22%,86.15%,68.15%。研究表明,随着ABA浓度的升高,PAL活性呈现先增强后减弱的趋势,并在浓度为5 mg·L-1时达到最大值。外源ABA浓度为2.5、7.5、10 mg·L-1时没有显著性差异,并且PAL活性明显高于对照组,表明外源ABA浓度可以直接有效地调节PAL活性,但PAL活性的变化波动并不显著。
图5 不同浓度外源ABA处理对连作障碍下栝楼PAL活性的影响Fig. 5 Effect on PAL activity of Trichosanthes kirilowii in different concentrations of exogenous ABA under the continuous cropping obstacles
2.6外源脱落酸对连作障碍下栝楼 APX活性的影响
抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX),可清除存在于细胞质中的H2O2,是调节细胞H2O2水平一种非常重要的酶。由图6可以看出,不同浓度的ABA处理的连作栝楼,APX活性的变化在个别处理组间出现显著性差异,处理组 T1、T2、T3比 T0分别提高了 179.37%,1163.49%,82.54%,而处理组T4比T1减少了38.1%,且在浓度为5 mg·L-1时,APX活性达到峰值。植株在外源ABA浓度为2.5 mg·L-1、7.5 mg·L-1时与对照组出现差异,但并不明显;当外源ABA浓度为10 mg·L-1时,APX的活性出现比对照组还降低的现象,明确了只有小范围内的外源 ABA浓度可以有效提高APX活性。有研究表明,当转基因棉花过表达tAPX时,其PSⅡ光化学活性和抗氧化能力都得到了提升(Komyeyev et al.,2001);tAPX过表达的转基因烟草和拟南芥植株都提高了对甲基紫精引起的氧化胁迫的耐受能力(Murgia et al.,2004)。所以,外源ABA可以有效提高植株抵抗连作障碍的能力,一定程度上提高其抗氧化能力。
图6 不同浓度外源ABA处理对连作障碍下栝楼APX活性的影响Fig. 6 Effect on APX activity of Trichosanthes kirilowii in different concentrations of exogenous ABA under the continuous cropping obstacles
2.7隶属函数均值连作障碍缓解分析
采用模糊隶属函数的方法,对试验中所测的 6个生理指标进行计算分析,综合评价不同浓度脱落酸处理缓解连作障碍的能力。如表 1所示,外源ABA对缓解栝楼连作障碍的能力为 T2>T3>T1> T0>T4。由此可知,T2处理组脱落酸处理对缓解栝楼连作障碍的影响效果是最好的。
表1 缓解连作障碍隶属函数指标及综合评价Table 1 Ease continuous cropping obstacles membership function indexes and comprehensive evaluation
栝楼一般种植2~3年后其产量会明显下降,而且根部有局部腐烂现象出现。年度内在植株开花后开始出现病株,表现为矮化、黄化、萎蔫、根腐、茎腐、伤流、凝胶等症状,甚至植株逐渐枯萎,病害蔓延。主要原因是栝楼连作使植物细胞膜系统产生的氧自由基受到刺激,破坏植物体内活性氧产生与清除之间的动态平衡,引起活性氧的积累,导致氧化胁迫。氧自由基可引起膜脂过氧化,使膜脂不饱和度下降、膜流动性降低、透性增加,并可使膜蛋白发生聚合、交联,破坏生物膜的结构和功能,进而影响植物的正常生长,甚至导致植物死亡。氧化胁迫主要是由活性氧(ROS)如单线态的氧、超氧负离子、过氧化氢及羟基自由基的形成导致的(Apel et al.,2004)。栝楼在良好的环境下,通常将活性氧(ROS)维持在较低水平,而在连作障碍条件下,细胞代谢过程不协调导致ROS水平升高,从而对细胞结构形成潜在的氧化胁迫。另外,在细胞不同部位发生的代谢作用必然导致ROS的产生,ROS水平的短暂升高转导植物信号进而对植物在不利环境下的生存起着至关重要的作用(Dat et al.,2000)。而且,植物由于在光合作用过程中释放大量的氧,作为光合作用部位的叶绿体,显然最易受到氧化胁迫的威胁。
目前已证明的活性最强活性氧是·OH,它可以直接引发脂质过氧化,严重时会导致植物细胞死亡(孙卫红等,2005)。自由基涉及到许多体内调控机制,能否及时高效地清除活性氧直接关系到植物抗逆性的强弱,因此抗氧化酶系在抗逆境的研究中颇受重视。本实验对超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化物酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性进行测定,探究外源ABA对栝楼连作障碍的缓解作用,对缓解栝楼连作障碍提供一些有价值的参考。当植物受到轻度环境胁迫时,SOD和POD活性有所升高,以增强植物对ROS的清除能力。当植物受到重度逆境胁迫时,SOD和POD活性又会大幅度降低,造成ROS的积累和对细胞的伤害(张琼等,2010),这个规律在本实验中也得到了验证。正常情况下植物体内SOD、POD、CAT、PPO、PAL和APX活性维持在一定的水平,从而去除不断产生的自由基,使植物体内抗氧化酶系活性以及ROS含量达到一定的平衡(高曦等,2014)。在清除氧自由基的过程中,抗氧化酶之间具有协同作用。当SOD把超氧化物歧化为H2O2后,CAT和POD在一定强度的环境胁迫下有互补的作用,因此不论H2O2浓度的高低,CAT和POD都可以高效发挥将H2O2消除的功能(李璇等,2013)。这6种抗氧化酶可能在不同的外源 ABA浓度下存在不同的应答机制,既相互依赖,又能够各自独立维持植株体内氧化平衡。在本实验中,可以看出抗氧化酶系的变化是被诱导的,一定浓度的外源脱落酸,使栝楼体内抗氧化酶系活性得到了不同程度提高,植株本身抗病菌能力也得到了提高。SOD作为唯一能特异性清除自由基的抗氧化酶,一直被认为是抵御过氧化物毒性的重要防御机制,本实验通过测定SOD活性可以看出外源ABA在不同的浓度下显著影响其活性,说明ABA是直接影响SOD活性的植物激素,外源ABA对SOD活性的调节能力更强。当外源ABA浓度为5 mg·L-1时,SOD活性达到峰值。在外源ABA处理中,SOD、POD、PPO、CAT、PAL、APX 6种酶活性反应整体上表现出一致性,只是前 3种酶表现出更加敏感,明显下降,其中以POD活性下降得最为显著。同时,尽管SOD、POD、PPO、CAT、PAL、APX6种酶在低浓度处理时都表现出增强效应,但活性变化的特性存在一定的差异,并非所有的指标均在 ABA浓度为 5 mg·L-1时酶活性达到最大值,PPO活性最大值出现在浓度为7.5 mg·L-1时,而且PPO的活性与栝楼连作枯萎也存在着密切的关系。PPO是一种含酮氧化酶,它与植物的逆性有关。有研究表明PPO活性增强会使植物产生酚类物质而转化为醌类物质,抑制植物不定根的产生,使植物渐趋死亡,即过高的多酚氧化酶活性会给植株带来一定的伤害(杨广超,2004)。所以,高活性PPO并不代表其能够更加有效地缓解栝楼的连做障碍,相反可能促进了栝楼连做障碍,其作用机理有待进一步的研究。
综上所述,在适当浓度的外源ABA作用下,连作障碍下的栝楼在抗氧化酶系活性方面得到显著的增强,超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化物酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性总体随处理的外源ABA浓度的升高而呈现先增强后减弱的趋势。通过模糊隶属函数均值分析可知,5 mg·L-1的ABA为缓解连作障碍的最佳浓度。如果要从根源上消除连作障碍,还需要从根系分泌物、致病细菌和土壤微生物等因素来综合研究。本研究还发现,当外源ABA浓度超出一定范围后,植株的抗病能力不但没有得到提高,反而可能致使生理代谢紊乱,抑制各种抗氧化酶的活性,妨碍植株正常生长。虽然在栝楼连作障碍下,各种酶之间协同互作真正的机理还有待深入研究,但是本试验结果已经明确了它们对植物细胞防御外界伤害有着重要的作用,这是防止植物在连作障碍下受到氧化物伤害的重要因素,表明抗氧化酶系活性的提高是栝楼在连作障碍下的重要生理反应。当然栝楼的连作障碍是一个复杂的生理过程,后续的试验中仍需重视抗氧化酶系之间的相互作用及其与连作障碍之间的关联,对连作障碍的致病机理也有待更加深入的探究。
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Effect of Exogenous Abscisic Acid on Anti-oxidative Enzymes of Replanted Trichosanthes kirilowii Maxim.
LIU Dan1,2, WU Yuhuan3, SHEN Yang1, PAN Shaoan1, ZHANG Lujun1, CAO Lin2, MA Li2, LI Feng1, ZHANG Yi4, XU Gendi1,2, LIU Peng1,2*
1. Research Institute of Ecology, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China; 2. Research Institute of Botany, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China; 3. College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 330036, China; 4. Tourism College of Zhejiang, Hangzhou 311231, China
To figured out the mechanism of mitigating the injure of continuously-cropping obstacle with abscisic acid Trichosanthes kirilowii which had continuously cultivated for three years under normal circumstance was chosen as experimental materials to explore the effect of abscisic acid (ABA) which irrigating with different concentrations (0, 2.5, 5, 7.5, 10 mg·L-1) on activities of antioxidant enzymes in leaves . The results showed that the activities of antioxidant enzymes of Trichosanthes kirilowii seedlings which had treated with exogenous ABA for seven days and measured activity of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD), peroxidase (CAT), polyphenol oxidase (PPO), phenylalanine ammonia lyase (PAL) and ascorbate peroxidase (APX) of the leaves sample after another seven days showed a downward trend after a rise trend under normal circumstances. In addition to PPO activity which peak concentration of exogenous ABA is 7.5 mg·L-1, the remaining enzyme activities peaks occurred at 5 mg·L-1. When the concentration of exogenous ABA is too high, it appeared the phenomenon that the SOD, POD and CAT activities are lower than the activities of control group and other disadvantageous circumstances. The membership function analysis concluded that when the concentration of exogenous ABA is 5 mg·L-1, the ABA can effectively alleviate the injury of continuously-cropping obstacles of Trichosanthes kirilowii.
continuously-cropping obstacle; Trichosanthes kirilowii Maxim.; abscisic acid; anti-oxidative enzymes
10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.12.010
Q945.79; X17
A
1674-5906(2015)12-1989-06
国家自然科学基金项目(41541049;30540056);浙江省公益技术研究农业项目(2011C22053)
刘丹(1991年生),女,硕士研究生,主要从事环境修复和植物营养的研究。E-mail: liudan22041991@sina.com *通信作者:刘鹏(1965年生),男,教授,博士,主要从事生理生态、环境修复和植物营养的研究。E-mail: pliu99@vip.sina.com
2015-09-26
引用格式:刘丹, 吴玉环, 沈洋, 潘少安, 张露军, 曹林, 马丽, 郦枫, 章艺, 徐根娣, 刘鹏. 外源脱落酸对连作障碍下栝楼抗氧化酶系的影响[J]. 生态环境学报, 2015, 24(12): 1989-1994.