高效液相色谱法测定地塞米松植入剂的有关物质

任翠丽，夏伦洋，尹情胜，王世亮，3，吴永贵，周春霞

(1.合肥工业大学控释药物研究室;2.安徽中人科技有限责任公司;3.安徽四维药业有限公司，安徽合肥 230009;4.安徽医科大学第一附属医院肾内科，安徽合肥 230022)

地塞米松为糖皮质激素类药物，临床主要用于替代疗法、自身免疫性疾病、过敏性疾病、严重感染、抗休克、血液系统疾病等。本研究小组研发的新剂型新产品—地塞米松植入剂，该植入剂体积较小(呈圆柱体，直径0.8 ～0.9 mm，长 2 ～4 mm)，为白色或类白色，用于治疗肾病综合证，可通过一定的技术手段植入肾囊，药物到达局部后，缓慢释放，周期长达2个月。这样局部药物浓度较高，杀死病灶，全身血药浓度较低，使不良反应大大的减少［1－3］。这样可以避免或减少地塞米松传统给药的方式导致的全身不良反应(满月脸、水牛背、向心性肥胖、高血压、低血钾等)。本文查阅了一些相关文献［4－13］并在相应的实验基础上，建立了高效液相色谱法测定地塞米松植入剂的有关物质。

1 仪器与试药

1.1 仪器 电子天平(METTLER TOLEDO，型号XA105)、数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，型号KQ－100DE)、高效液相色谱仪(日本岛津，型号LC－15C)。

1.2 试药 地塞米松植入剂(批号:20131225，20140113，20140216，标示量 2 mg)、对照品地塞米松、倍他米松购于中国药品生物制品检定所(批号分别为 100129－200804、100118－200803)、甲醇(色谱纯，SIGMA －ALDRICH.CO)、乙腈(色谱纯，Product of Tedia United states of America)、聚乳酸(安徽中人科技有限责任公司合成组提供，分子量约17000，批号20131228)、聚乙二醇6000(北京市海淀区精细化工厂)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱:天津兰博 Kromasil-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm，S/N:09253924);流动相:乙腈—水(28∶72，V/V)，流速:2.0 mL ·min－1，检测波长:240 nm，柱温:35 ℃，进样量:20 μL，取“2.2.4”项下的对照溶液 20 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序依次为倍他米松峰与地塞米松峰，分离度应符合要求［14］。

2.2 溶液的配制

2.2.1 制剂溶液配制 取本品约51 mg(相当于地塞米松5 mg)，精密称定，置于10 mL量瓶中，加入1 mL乙腈，35℃超声处理30 min，取出，放冷，加甲醇定容至刻度并摇匀，过滤，作供试品溶液。

2.2.2 地塞米松储备溶液 取地塞米松标准品约10.00 mg，精密称定，置于20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成0.5 mg·L－1的储备溶液。

2.2.3 倍他米松储备溶液(杂质溶液) 精密称取倍他米松标准品10.00 mg于20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成0.5 mg·L－1的储备溶液。

2.2.4 0.5%自身对照品溶液(5 mg·L－1) 精密移取“2.2.2”项和“2.2.3”项溶液各 1 mL 于 100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。

2.3 检测波长的确定 分别取地塞米松储备溶液和杂质倍他米松溶液适量，在200～600 nm波长范围内扫描。地塞米松在240 nm处有最大吸收，而杂质倍他米松在此处也有吸收，并使用本实验中的色谱条件，使原料药及其杂质能有效分离。因此选240 nm为本品有关物质检查的检测波长。

2.4 空白辅料干扰实验 按制剂处方比例取各辅料适量(约88 mg)，混匀。置于10 mL量瓶中，加入1 mL乙腈，35℃超声处理30 min，取出，放冷，加甲醇定容至刻度并摇匀，过滤，取续滤液20 μL，照上述色谱条件，注入液相色谱仪进行测定，并记录结果，结果见图1。结果表明，空白辅料只有溶剂峰，未在主峰及杂质峰处出峰，对主药及各杂质的测定无干扰。

2.5 线性关系 分别精密量取“2.2.2”项和“2.2.3”项下的溶液各1 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇定容，摇匀。作线性储备液(50 mg·L－1)，依次逐步稀释成 10，5，2.5，1，0.5，0.25，0.1 mg·L－1的溶液。分别精密移取上述溶液20 μL注入液相色谱仪，记录峰面积，以浓度(X，mg·L－1)为横坐标，色谱峰面积(Y)为纵坐标进行回归，得地塞米松、杂质倍他米松的回归方程分别为:Y=27 863X －682，r=0.999 8;Y=27 210X －660 ，r=1.0000。表明地塞米松及杂质倍他米松在0.1～10 mg·L－1浓度范围内，线性关系良好。

2.6 定量限 以信噪比为10∶1的浓度为定量限检测溶液，进样20 μL，重复6次。结果地塞米松、杂质倍他米松的最低定量限分别为 1.17、1.04 μg·L－1。

2.7 检测限 以信噪比为3∶1的浓度为检测限检测溶液，进样20 μL，重复6次。结果地塞米松、杂质倍他米松的最低检测限分别为 0.39、0.34 μg·L－1。

2.8 重复性 按“2.2.1”项下供试品溶液的配制方法配制6份供试品溶液;取上述1份供试品溶液1 mL于100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制对照溶液;另取系统适用性溶液分别进样20 μL，记录峰面积，计算RSD。结果RSD为0.35%，表明该方法重复性良好。

2.9 中间精密度 分别于d 2和d 3重复“2.8”项的操作，记录峰面积，计算RSD。结果RSD分别为1.15%和2.17%，表明该方法精密度良好。

2.10 稳定性 取供试品溶液、0.5%自身对照品溶液和系统适用性溶液，室温下放置8 h，分别于0，2，4，6，8 h 进样 20 μL，记录峰面积，计算 RSD。结果地塞米松和杂质倍他米松的RSD分别为0.29%，0.78%，表明其溶液在8 h内稳定。

2.11 加样回收率 精密量取上述“2.2.3”项溶液1 mL于20 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为杂质储备液(25 mg·L－1);另取地塞米松植入剂9份(每份约相当于地塞米松5 mg)，精密称定，置于10 mL量瓶中，加入1 mL乙腈，35℃超声处理30 min，取出，放冷，分别加入 0.8、1.0 和 1.2 mL 的杂质储备液，用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液制成含杂质倍他米松量分别为80%、100%和120%的低、中、高三组供试液，每组三份。分别取上述溶液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。计算各浓度下的回收率和相对标准偏差。

表1 加样回收率试验结果

2.12 耐用性 在本实验方法的基础上，分别改变流速(1.8 mL·min–1和 2.2 mL·min–1)、柱温(30℃和40℃)、流动相中乙腈的比例(25%和30%)、不同色谱柱(Kromasil-C18)、取供试品溶液和系统适用性溶液，每个条件分别进样3次，考察本实验的耐用性。结果表明，地塞米松、杂质倍他米松的出峰时间、柱效、出峰情况相似，不同条件下测定供试品溶液的有关物质RSD为0.29%，表明本方法耐用性良好。

2.13 专属性 按如下方法分别对地塞米松原料药、自制地塞米松植入剂及空白辅料进行破坏性试验。

2.13.1 酸破坏 称取样品适量(约含地塞米松5 mg)，置于10 mL量瓶中，加入1 mL乙腈，35℃超声处理30 min，取出，放冷后，加1.2 mL浓硫酸，室温下放置2 min，用 1.0 mol·L－1氢氧化钠溶液中和至pH值为中性，加甲醇定容至刻度，摇匀，过滤。

2.13.2 碱破坏 称取样品适量(约含地塞米松5 mg)，置于10 mL量瓶中，加入1 mL乙腈，35℃超声处理 30 min，取出，放冷后，加 1.0 mol·L－1氢氧化钠溶液 0.5 mL，室温下放置 5 min，用 1.0 mol·L－1盐酸溶液中和至pH值为中性，加甲醇定容至刻度，摇匀，过滤。

2.13.3 氧化破坏 称取样品适量(约含地塞米松5 mg)，置于10 mL量瓶中，加入1 mL乙腈，35℃超声处理30 min，取出，放冷后，加30%双氧水2 mL，加甲醇4 mL，60℃水浴下放置2 d，取出放冷后，加甲醇定容至刻度，摇匀，过滤。

2.13.4 高温破坏 取样品适量，置150℃烘箱中烘烤2 h，冷却，称取适量样品(约含地塞米松5 mg)，置于10 mL量瓶中，加入1 mL乙腈，35℃超声处理30 min，取出放冷后，加甲醇定容至刻度，摇匀，过滤。

2.13.5 强光破坏 称取样品适量(约含地塞米松5 mg)，置于10 mL量瓶中，加入1 mL乙腈，35℃超声处理30 min，取出，放冷后，加甲醇定容至刻度，摇匀，过滤。置(4 500±500)Lx的低温光照仪中3 d，依法检查。试验结果表明，样品在强光破坏3 d、酸破坏、碱破坏、高温、氧化破坏后，主峰均有所降解，杂质峰均能与主峰分离，说明本法的专属性较好，见图2。

2.14 样品中有关物质的测定 取3批自制样品(批号:20131225，20140113，20140216)按照“2.2.1”项方法配制供试品溶液，另取倍他米松对照品，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1 mL中约含0.5 mg的溶液，分别精密量取倍他米松1 mL置100 mL各量瓶中，再分别精密加各供试品溶液1 mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取各供试品溶液及对照品溶液20 μL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，记录色谱图。结果3批样品总杂质分别为 0.79%，0.87%，0.68%，最大单个杂质分别为 0.015%，0.024%，0.019%，符合有关规定。

3 讨论

3.1 流动相的选择 分别用了甲醇—水(70∶30，V/V)和乙腈—水(32∶68，V/V)［1］作为流动相，但对照溶液中倍他米松与地塞米松的分离度小于1.5。未达到《中国药典》2010年版二部中提及地塞米松有关物质测定项下的要求。参考文献［14］资料，经过反复试验调整流动相中乙腈的比例，当流动相调整为乙腈—水(28∶72，V/V)时，倍他米松与地塞米松的分离度大于1.5，供试品中的杂质峰分离度、对称因子及保留时间较好。因选用其为流动相。

3.2 流速的选择 在做初始优化阶段选择时，主要参考了文献［13］，流速为 1.0 mL·min－1时，样品分析时间太长，经逐步摸索。选择2.0 mL·min－1时，柱压:15～17 MPa，流动相为乙腈—水(28∶72，V/V)，该流动相仍可算做低柱阻良好性能溶剂。因此可选较高流速而不必担心泵的损坏。研究实践中观察到:在进行样品测定时，内源性干扰组分较少，各组分能有效分离(分离度在1.5以上)。因此流速较高带来的分离较差的影响，暂时可不考虑。综合考虑选择流速2.0 mL·min－1。

3.3 溶剂的选择 刚开始用流动相溶解样品时，肉眼观察样品溶解不了，有沉淀物，根据《中国药典》2010年版二部中提及地塞米松略溶于乙醇，用无水乙醇溶解，肉眼观察不到有沉淀物，但在录制色谱图时，发现地塞米松出现双峰现象;尝试用乙腈溶解样品，结果发现地塞米松、倍他米松的分离度及塔板数较低，达不到要求，经摸索，先用少量乙腈(1 mL)超声溶解样品，再用甲醇(约9 mL)定容，这样分离度及塔板数均能符合要求。

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