生物絮凝剂的制备及其在蔗汁澄清的应用探索

李雨虹，曾练强，马 步，钟志才，常国炜，黎志德，徐艳芳，梁达奉,

（1广州甘蔗糖业研究所 广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东广州510136；2广西糖业研发中心，广西南宁530002；3广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁530004）

生物絮凝剂的制备及其在蔗汁澄清的应用探索

李雨虹1，曾练强1，马 步2，钟志才1，常国炜1，黎志德1，徐艳芳3，梁达奉1,2

（1广州甘蔗糖业研究所 广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东广州510136；2广西糖业研发中心，广西南宁530002；3广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁530004）

以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为出发菌株，通过紫外诱变选育出一株产絮凝剂的高效菌株，经过摇瓶发酵生产生物絮凝剂(MBF)对甘蔗中和汁进行澄清试验。结果表明，突变株比出发菌株产MBF的絮凝活性提高17%；10 U/mL 的MBF与2 mg/kg聚丙烯酰胺(PAM)处理甘蔗中和汁澄清效果相当。MBF取代PAM作为糖用絮凝剂具有可行性。

紫外诱变；生物絮凝剂；甘蔗中和汁；澄清

0 引言

蔗汁澄清是制糖工艺中的关键环节，絮凝剂在其中起着重要的作用。我国的制糖工业在上世纪60年代后期开始在蔗汁澄清中采用高分子聚合物作絮凝剂，目前国内糖厂澄清应用效果最好的是聚丙烯酰胺(PAM)，但其潜在的使用安全性和二次污染问题却越来越受到关注[1-3]。伴随人们环保意识的增强和行业管理越来越规范化，特别在食品行业对絮凝剂的安全性和环保性提出了更高的要求，开发安全无毒、无二次污染的糖用生物絮凝剂对食糖的安全具有重要的现实意义。

迄今为止，已经报导的生物絮凝剂(MBF)产生菌就有超过60多种，但絮凝剂用量大，成本高等问题制约了生物絮凝剂在工业上广泛应用[4]。因此，

寻找高效微生物絮凝剂产生菌，提高絮凝活性，降低絮凝剂用量，成为生物絮凝剂能否在工业上推广的关键。微生物诱变育种能够分离筛选优良的菌株，已被广泛应用。常用的微生物育种方法，主要有物理诱变、化学诱变和两者复合诱变[5]。作为物理诱变的一种，紫外诱变具有设备简单、效率高、操作简单等优点。本试验以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为出发菌株，通过紫外诱变选育出一株产絮凝剂的高效菌株，摇瓶发酵制备生物絮凝剂应用于广西农垦糖业集团金光制糖有限公司的甘蔗中和汁进行澄清试验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株

絮凝剂产生菌地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，由厦门大学提供。

1.1.2 样品

硫熏中和汁来自广西农垦糖业集团金光制糖有限公司2014/15年榨季生产线取样。

1.1.3 培养基

1.1.3.1 种子培养基(g/L)

葡萄糖10，酵母膏0.5，尿素0.5，KH2PO40.1，K2HPO40.1，NaCl 0.1，MgSO40.2，pH 7.2

1.1.3.2 平板培养基(g/L)

蔗糖10，酵母膏1，尿素1，NaCl 0.1, KH2PO40.1，K2HPO40.1，MgSO40.2，琼脂15.0，pH 7.2

1.1.3.3 发酵培养基(g/L)

葡萄糖13.4，酵母膏0.6，尿素2.35，KH2PO45.6，K2HPO41.4，NaCl 2，MgSO40.055，pH 7.2

1.2 方法

1.2.1 培养方法

1.2.1.1 菌种活化

将出发菌转接到新鲜斜面培养基内，37℃培养12 h。

1.2.1.2 种子培养

取一环活化后的菌株接入装有50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，于37℃、200 r/min下摇瓶培养16 h。

1.2.1.3 发酵培养

以2%的接种量(v/v)将种子液接入发酵培养基中，于37℃、200 r/min下摇床培养48 h。

1.2.2 紫外线诱变[6]

将地衣芽孢杆菌新鲜斜面用0.85%的生理盐水将菌苔洗下，3000 r/min离心10 min，弃上清，用生理盐水洗涤菌体2-3次，制成单细胞菌悬液，用显微镜直接计数法调整细胞浓度为108个/mL。取5 mL菌悬液于9 cm内有磁力搅拌子的无菌平皿中，置于磁力搅拌器上，于波长253.7 nm，功率 8 W的紫外灯下，距离20cm，照射60 s后开盖振荡照射。照射20、25、30、35、40、50、60 s分别取样，放置于冰水中1～2 h，采用10倍稀释法，选择每个平板上长有50～200个菌落的稀释度涂布平板培养基，每个稀释度3个平行，于37℃进行暗培养24 h。并设立对照，最后进行活菌计数，计算致死率。致死率=﹙1-诱变后活菌数／诱变前活菌数﹚×100%。

1.2.3 突变株的筛选

挑选形态大，表面光滑，周边粘稠的单菌落初筛，接至斜面培养基培养保存。在发酵培养基中，对初筛得到的单菌落复筛，37℃、200 r/min下摇床培养48 h后测定絮凝率，保存絮凝活性较高的菌种。

1.2.4 菌种稳定性考察

将复筛得到的菌株与出发菌株进行平行继代遗传稳定性实验，转接5代，再进行摇瓶发酵，测定发酵液的絮凝活性，观察其遗传稳定性。

1.2.5 絮凝率的测定

50 mL具塞比色管中加入40 mL 10 g/L高岭土悬浮液，2.5 mL 10 g/LCaCl2溶液，1 mL发酵液，加蒸馏水至刻度，摇匀后静置5 min，用分光光度计在550 nm处测定吸光度A，以空白发酵培养基的吸光度A0为对照确定培养液的絮凝活性，以絮凝率表示：絮凝率(%)=（A0-A）/A0×100%。

1.2.6 絮凝活性成分的稳定性

1.2.6.1 絮凝活性成分的热稳定性

取发酵液于若干试管中（10 mL/管），分别在20、30、40、50、60、70、80、90、100℃温度下水浴加热30 min，按1.2.5节方法测定它们的絮凝活性。

1.2.6.2 絮凝活性成分pH稳定性

取发酵液于若干个试管中（每管10 mL），分别在pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11下，4℃放置24 h后按照1.2.5节方法测定它们的絮凝活性。

1.2.7 絮凝实验

取生产流程上的硫熏中和汁（硫熏强度20 cc，pH 7.0～7.2），加热煮沸，加MBF或PAM（絮凝剂

用量按实验定量），搅拌均匀，迅速倒入500 mL的量筒中沉降，计时并记录沉降速度，取清汁分析。

2 结果与分析

2.1 诱变时间的选择

紫外线照射时间对菌株致死率的影响见图1。在照射20 s时，其致死率己达到66.4%，由此可见出发菌株对紫外线较敏感。根据致死率为90%左右的诱变效果最好[7]，选取诱变时间为25 s。

图1 紫外诱变菌株致死率曲线

2.2 菌种筛选

出发菌株（絮凝率65.0%）经过紫外线照射诱变后，筛选得到絮凝活性较高的正突变菌株，经过反复筛选，获得1株絮凝率达76.0%的正突变菌株。

由于诱变菌株的性状常常不稳定，尤其是在连续传代培养时，为了检测菌株性状是否稳定，将诱变出的菌株在斜面继代培养5代，分别检测每代的絮凝率，最后得到1株絮凝性能稳定的菌株，每代的絮凝率分别为76.0、74.3、75.2、73.8、74.9、73.1%，5代絮凝率没有显著性差异。说明传代次数对絮凝率影响不显著，诱变菌株遗传性能稳定。

2.3 絮凝剂的热稳定性

为了考察该絮凝剂的热敏性，将发酵液分别在不同的温度下水浴加热30 min后，测定其絮凝活性变化情况，由絮凝活性的变化趋势来确定该絮凝剂对温度的敏感程度，结果如图2所示。由图2可知，高温加热对絮凝剂的活性影响不大。

2.4 絮凝剂的pH稳定性

将发酵液的pH调至不同的值，于4℃冰箱放置24 h后，测定其絮凝活。结果如图3所示。由图3可知，絮凝剂定pH为3～11范围内保持了良好的絮凝稳定稳。

图2 生物絮凝剂的热稳定性

图3 生物絮凝剂的pH稳定性

2.5 最适生物絮凝剂添加量确定

取约3500 mL硫熏中和汁，加热煮沸后分别量取500 mL各加入2 ppm PAM（0.067%浓度1.5mL）、5、10、15、20 U/mL MBF，以不加任何絮凝剂的中和汁为空白，搅拌均匀后迅速倒入500 mL量筒中。观察并记录沉降速度，静置30 min后分别取上清汁分析锤度、pH值、色值、纯度，结果见表1。

表1 最适生物絮凝剂添加量

由表1可知，中和汁加热至100℃，无论是否加絮凝剂都能沉降，絮凝剂加入量不同沉降速度也不同。其中不加絮凝剂的空白组沉降速度最慢，且肉眼能观测到清汁有微粒悬浮；加絮凝剂组的泥汁颗粒较大，沉降速度较快。加2 mg/kg PAM组沉降速度最快，加MBF组的沉降速度以10 U/mL组的沉降速度接近加2 mg/kg PAM组沉降速度，多于10 U/mL组的沉降速度反而下降，因此选择10 U/mL MBF替代PAM进行下一步试验。

2.6 PAM、MBF及复合絮凝剂的澄清工艺比较

取约3500 mL硫熏中和汁，加热煮沸后分别量取500 mL各加入2 mg/kg PAM、10 U/mL MBF、5 U/mL MBF+1 ppm PAM搅拌均匀后迅速倒入500 mL量筒中。观察并记录沉降速度，静置30 min后取上清汁分析锤度、pH值、色值、纯度。倾出清汁留125 mL泥汁进行泥汁过滤效果评价，数据见表2。结果表明复合絮凝剂组的沉降速度优于MBF组，更接近PAM组。对清汁质量指标及泥汁过滤效果进行比较，从清汁质量指标看，各组的沉降清汁pH、锤度、色值、纯度均没有很大的差异。从泥汁过滤速度来看，PAM组的过滤速度明显快些，应该与泥汁颗粒大小有关，这个因素有待进一步实验探讨。

表2 PAM、MBF及复合絮凝剂对中和汁的絮凝效果

3 结论

本研究用紫外线诱变处理地衣芽孢杆菌，经初筛、复筛最终得到1株产絮凝剂的高效菌株，其絮凝活性较出发菌株提高17%。稳定性试验结果表明该菌株具有良好的热稳定性及广泛的pH稳定性。

蔗汁澄清是制糖工业生产的关键环节，絮凝剂在其中起着至关重要的作用。就当前而言，仍未有一种十分满意的糖用絮凝剂。通过上述试验可以看到，生物絮凝剂具有取代聚丙烯酰胺的潜力，可以应用在蔗汁澄清工艺；生物絮凝剂与聚丙烯酰胺协同使用，蔗汁的沉降速度与单独使用聚丙烯酰胺接近，且清汁各项质量指标均没有明显差异。将具有安全无二次污染等优点的生物絮凝剂应用于制糖工业，部分或完全取代有毒性残留隐患的聚丙烯酰胺在技术上是可行的。糖用生物絮凝剂的开发，将会对我国制糖工业提高经济效益、提高产品质量起到良好的促进作用。

[1] 李善斌，孙卫东. 糖用絮凝剂在制糖过程中的应用进展[J]. 广西轻工业，2010，26(2)：6-7，48.

[2] 钟志才，徐杰荣，黄俊生，等. 糖厂常用絮凝剂的应用研究和新型絮凝剂的展望[J]. 广西糖业，2014(6)：34-40.

[3] CHAI S L, JOHN R, MEI F C. A review on application of flocculants in wastewater treatment[J]. Process Safety and Environmental Protection, 2014, 92(6): 489-508.

[4] 李雨虹，梁达奉，常国炜，等. 微生物絮凝剂研究进展[J].甘蔗糖业，2014(5)：51-56.

[5] 吴焕利，冯贵颖，赵淑艳，等. 紫外诱变选育高效微生物絮凝剂产生茵及其应用[J]. 西北农林科技大学学报：自然科学版，2008，36(8)：113- 118.

[6] 沈萍，陈向东. 微生物学实验：4版[M]. 北京：高等教育出版社，2008：127.

[7] 施巧琴，吴松刚. 工业微生物育种学：3版[M]. 北京：科学出版社，2009：37-38．

(本篇责任编校：朱涤荃)

Preparation of Bioflocculant and Its Application in Clarification Process of Sugarcane Juice

LI Yu-hong1, ZENG Lian-qiang1, MA-Bu2, ZHONG Zhi-cai1, CHANG Guo-wei1, LI Zhi-de1, XU Yan-fang3,
LIANG Da-feng1,2
(1Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute/Guangdong Key Lab of Sugarcane Improvement & Biorefinery, Guangzhou 510136;2Guangxi Sugarcane Industry R & D Center, Nanning, Guangxi 53000;3Insitute of Light Industry and Food Engineering, Guangxi University, Nanning, Guangxi 530004)

A bioflocculant production mutant was screened from Bacillus licheniformis by ultraviolet (UV), and tested the flocculation in clarification of the neutral juice. The results showed that flocculation rate of mutant was increased by 17% compared with the original strain. The 10 U/mL bioflocculant had comparative effect in clarification of the neutral juice with 2 mg/kg polyacrylamide, indicating the possibility of bioflocculant application in sugar industry.

Ultraviolet mutagenesis; Bioflocculant; Neutra1 juice; Clarification

TS244+.2

A

1005-9695(2015)05-0033-05

2015-09-15；

2015-10-15

南宁市工信委技术创新项目（编号2014-1-30）；八桂学者建设工程专项经费资助

李雨虹(1981-)，女，工程师，主要从事食品生物技术研究工作

*通讯作者：梁达奉(1964-)，男，博士，教授级高级工程师，国家甘蔗产业技术体系岗位科学家，主要研究方向：制糖生物技术；

E-mail:ldfjt@126.com

李雨虹，曾练强，马步，等. 生物絮凝剂的制备及其在蔗汁澄清的应用探索[J]. 甘蔗糖业，2015(5)：33-37.