Akt/mTOR信号通路介导低浓度过氧化氢对小鼠表皮干细胞的促增殖作用

亓俊华 聂 刚 吴 梅 刘晓萍 陈民佳 朱 明 袁培松 张 娅 宋昱庆 郭 韡 邢 伟 李向云 罗东林 黄 宏 徐 祥

（1.第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,第一研究室，重庆 400042；2.青岛大学医学院组织胚胎学教研室，山东 青岛 266071；3温州医科大学附属第一医院皮肤科，浙江 温州 325000；4. 青岛大学基础医学实验中心，人体显微结构学实验室，山东 青岛 266071）

论 著

Akt/mTOR信号通路介导低浓度过氧化氢对小鼠表皮干细胞的促增殖作用

亓俊华1,2聂 刚3吴 梅4刘晓萍2陈民佳1朱 明1袁培松1张 娅1宋昱庆1郭 韡1邢 伟1李向云1罗东林1黄 宏1徐 祥1

（1.第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,第一研究室，重庆 400042；2.青岛大学医学院组织胚胎学教研室，山东 青岛 266071；3温州医科大学附属第一医院皮肤科，浙江 温州 325000；4. 青岛大学基础医学实验中心，人体显微结构学实验室，山东 青岛 266071）

目的：探讨低浓度过氧化氢（H2O2）对小鼠表皮干细胞（mESCs）体外促增殖作用及其机制。方法：以酶消化法分离培养mESCs。免疫荧光技术鉴定第3代mESCs β1整合素和角蛋白19（K19）表达，流式细胞术鉴定CD34的表达；以不同低浓度H2O2（0、25、50、100、150 和200 μmol/L）处理mESCs 48 h和72h。同时，另一组实验中在用不同浓度H2O2刺激的同时加入或不加入雷帕霉素（50 ng/ml）培养48 h。甲氮甲唑蓝（MTT）法检测细胞增殖； Western Blot 法检测H2O2刺激小鼠mESCs 48 h Akt/mTOR信号通路关键蛋白mTOR、Akt、P70s6k、eIF4E、4E-BP1、p-mTOR、p-Akt、p-P70s6k、p-eIF4E、p-4E-BP1和细胞增殖相关蛋白Cyclin D1、增殖细胞核抗原（PCNA）的表达。结果：免疫荧光技术检测分离培养的mESCs细胞100%表达 β1整合素和K19；流式细胞术检测99.8%的mESCs表达CD34；MTT检测结果显示，48 h和72 h时25 μmol/L和50 μmol/ L的H2O2可以有效地促进mESCs的增殖（P＜0.05），而雷帕霉素能拮抗这一效应；但当H2O2浓度为200 μmol/L时，则显著抑制mESCs增殖 (P＜0.05)；免疫印迹结果显示低浓度H2O2处理mESCs 48 h后，Akt/mTOR信号通路关键蛋白mTOR、Akt、eIF4E、4E-BP1水平及其磷酸化水平（p-mTOR、p-eIF4E、p-4E-BP1）显著增加 (P＜0.05或P＜0.01)，当H2O2浓度为200 μmol/L时则抑制其表达 (P＜0.05或P＜0.01)。此外，50 μmol/L的H2O2能上调细胞周期蛋白Cyclin D1和PCNA的表达，而雷帕霉素能拮抗这一作用。结论：低浓度的H2O2对mESCs有明显的促增殖作用，并且能激活Akt/mTOR通路。而低浓度H2O2对mESCs的促增殖作用至少部分是通过活化Akt/mTOR信号通路介导的。

表皮干细胞 过氧化氢 Akt/mTOR信号通路 细胞增殖

过氧化氢（H2O2）是一种强氧化剂，是外科领域广泛应用的消毒剂，具有杀菌、防腐、清洁创面的作用。然而临床医生惊奇地发现应用H2O2处理后的创面，不仅洁净、无感染，而且创面肉芽生长良好、创面关闭显著提前，显示出明显的促愈效应[1-2]。据报道,低浓度H2O2对创面有促愈效应，其机制主要是促进创面血管新生，促进成纤维细胞和内皮细胞增殖[1-3]。但低浓度H2O2对创面修复主要的始动细胞－表皮干细胞（mESCs）的作用尚不清楚。mESCs作为皮肤组织的特异性干细胞，是皮肤组织(含皮肤附件) 发生、创面修复及改建的关键细胞[4]。mESCs主要分布于表皮基底层和毛囊隆突部，皮肤损伤后，它们是促进再上皮化的主要修复细胞。因此，探讨mESCs的增殖分化以及调控机制对于临床修复皮肤损伤、治疗皮肤疾病、构建组织工程皮肤的意义十分重大。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalia target of rapamycin，mTOR）是一种存在于哺乳动物细胞中的Ser/Thr激酶，研究证明mTOR是调节细胞存活、增殖、迁移和血管生成的信号转导途径中的重要调控蛋白，相应的Akt/mTOR信号通路是维持皮肤内环境稳定和再生的重要信号通路[5-6]。研究证实，mTOR可以被活性氧活化[3]，根据氧化应激程度，它会造成细胞增殖、生长停止、衰老、凋亡（程序性细胞死亡）或坏死[7]。为此，我们通过体外分离培养mESCs，观察低浓度的H2O2对mESCs生长、增殖的影响，同时观察对细胞存活、增殖相关的Akt/mTOR信号通路关键蛋白Akt、mTOR、P70s6k 和eIF4E表达的作用，为低浓度的H2O2应用于临床创面治疗，尤其是难愈创面治疗提供充分的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 EMEM/F12（1:1）培养基（Hyclone公司），PBS粉剂（福州迈新生物技术开发有限公司），优质胎牛血清（FBS）、I型胶原酶、D-Hanks、胰酶、EDTA（Gibco公司），BSA、Hochest33342（Sigma公司）、β1整合素抗体（武汉博士德公司），鼠抗兔IgG（北京中山公司），角蛋白19(K19)抗体（博奥森公司），磷酸化mTOR (p-mTOR)、磷酸化Akt (p-Akt)、磷酸化P70s6k (p-P70s6k)、磷酸化eIF4E (p-eIF4E)、eIF4E、mTOR、Akt、P70s6k、β-actin抗体（Cell Signaling公司），Cyclin D1和PCNA（Santa公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠mESCs的分离提取 新生昆明小鼠，清洁级，购自第三军医大学大坪医院动物实验中心。无菌获取新生昆明小鼠背部皮肤，浸泡在无菌PBS溶液中充分清洗，用眼科剪和眼科镊尽量去除皮肤上附着的脂肪，将皮肤剪成1 mm ×1 mm大小的小块，置于0.02%的I型胶原酶中4 ℃过夜，次日用眼科镊小心分开表皮和真皮，表皮用含有0.02%EDTA和0.25%胰酶的消化液37 ℃消化30 min，过400目细胞筛，置于含有10%FBS的DMEM/F12培养基中，在37 ℃，5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞融合率达到80%时传代，倒置相差显微镜下观察细胞状态。

1.2.2 免疫荧光技术鉴定小鼠mESCs 取第3代mESCs接种于载玻片上，4%多聚甲醛室温固定，5%BSA 37 ℃封闭30 min；滴加1%BSA稀释的β1整合素和角蛋白19（K19）抗体（1:100）， 4 ℃孵育过夜；加异硫氰酸荧光素 (FITC)标记的二抗，37 ℃孵育2 h，Hochest33342染核，50%三磷酸甘油封片。

1.2.3 流式细胞术检测小鼠mESCs CD34的表达 取融合率达到80%的第3代mESCs，用不含EDTA的0.25%胰酶消化、离心、计数，取1×105～1×108个细胞，分两管，用无菌PBS洗两次，用100 μl PBS稀释的CD34-FITC抗体及其同型对照抗体室温孵育30 min，上机检测。

1.2.4 甲氮甲唑蓝（MTT）法检测低浓度的H2O2对mESCs增殖的影响 取对数生长期细胞，以每孔3×103个细胞（100 μl）的数量接种在96孔板。实验①：以不同终浓度H2O2（0、25、50、100、150和200 μmol/L）刺激mESCs，在37 ℃，5%CO2条件下常规培养48 h、72 h。实验②：用不同浓度H2O2（0、25、50、100、150和200 μmol/L）刺激mESCs的同时加入或不加入雷帕霉素50 ng/ ml，培养48 h。细胞在处理完毕之后，每孔加入5 g/L MTT 20 μl，继续培养4 h，吸出培养液，加入DMSO 150 μl充分溶解，待甲臜完全溶解后，用酶标仪在波长490 nm处读取吸光度（A490）值。

1.2.5 免疫印记技术（Western Blot）检测低浓度H2O2对细胞Akt/mTOR信号通路蛋白表达的影响 mESCs经不同浓度H2O2刺激48 h后，提取细胞蛋白，BCA法测定蛋白质浓度。各组取50 μg等量总蛋白上样，经8%、10%、15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）分离后，半干转膜至PVDF膜上，8 V转膜90 min。5%脱脂牛奶－PBS封闭2 h；分别加入以下一抗： mTOR、Akt、 P70s6k、eIF4E、4E-BP1、p-Akt(308)、p-mTOR、p-P70s6k、p-4E-BP1、p-eIF4E (均为1:500稀释)或β-actin (1:5 000稀释)，4 ℃摇床上孵育过夜。次日洗膜，加入二抗（羊抗兔，1:10 000稀释），室温孵育2～3 h。洗膜后，采用辣根过氧化物酶标记的增强型化学发光法显色，显影于X光片上。采用LabWorks4.6软件对目的蛋白和β-actin条带行灰度值分析，以两者比值代表目的蛋白表达的相对量。

1.2.6 Western Blot检测雷帕霉素对低浓度H2O2诱导的干细胞增殖蛋白表达的影响 0和50 μmol/L的 H2O2刺激联合和不联合50 ng/ml的雷帕霉素刺激mESCs 48 h后，收集细胞，提取蛋白，采用1.2.5中的方法继续实验，但一抗改为：Cyclin D1（1:500）和PCNA（1:500）。

1.3 统计学处理 数据采用SPSS10.0统计软件处理，用x±s表示，采用t检验分析比较两组间的显著性差异，采用Tukey检验进行多组间分析。P＜0.05为差异有显著性，P＜0.01 为差异有非常显著性。

2 结 果

2.1 mESCs的形态 在倒置相差显微镜下观察发现，培养的mESCs呈现出克隆状生长（图1，见封二），细胞形态呈圆形或梭形，细胞体积较小，核质比大，胞内的细胞器稀少。

2.2 免疫荧光技术检测mESCs β1整合素和K19的表达 免疫荧光技术可以检测到mESCs表达β整合素和K19，且阳性率达到100%（图2，见封二）。

2.3 流式细胞术检测CD34的表达 流式细胞术检测到第3代mESCs 阳性表达CD34，且表达率高达99.8%（图3）。

图3 流式细胞术检测mESCs CD34的表达

2.4 MTT法检测H2O2刺激对mESCs增殖的影响 与对照组（H2O2浓度为0）比较，在不同低浓度H2O2刺激mESCs 48 h后，可观察到只有25、50 μmol/L的H2O2对mESCs有明显的促增殖作用（P＜0.05）；随着H2O2浓度的增加，尤其是在150、200 μmol/L时细胞增殖受到明显的抑制（P＜0.05）；而在不同低浓度H2O2刺激72 h时也可以观察到相似的变化趋势，只是在25和50 μmol/L时，其促增殖作用更为明显（P ＜0.05，图4）。

图4 MTT法检测H2O2刺激mESCs 48 h和72 h细胞的增殖

2.5 低浓度H2O2对Akt/mTOR信号通路蛋白表达的影响

2.5.1 Akt和mTOR蛋白表达及其磷酸化水平的变化 不同低浓度H2O2刺激mESCs 48 h后，与对照组（H2O2浓度为0）比较，H2O2为25～100 μmol/L 时，细胞总的Akt和mTOR蛋白表达均显著增加 （P＜0.05或 P＜0.01），在H2O2浓度为150 μmol/L时，总Akt表达仍高于正常，但200 μmol/L浓度时，总Akt表达则低于正常，而总mTOR蛋白表达在这两个浓度刺激下基本维持正常水平（图5）。

图5 Western Blot检测低浓度H2O2刺激诱导mESCs细胞Akt和mTOR总蛋白表达的变化

H2O2浓度在25～100 μmol/L范围时， p-mTOR和p-Akt蛋白的表达显著增加（P ＜0.05），在H2O2浓度为150 μmol/L时，p-mTOR仍然维持高水平，而p-Akt基本降至正常水平；H2O2浓度为200 μmol/L时，两者表达均与对照组（H2O20 μmol/L）一致(图6)。

图6 Western Blot检测低浓度H2O2刺激诱导mESCs细胞p-Akt和p-mTOR蛋白表达的变化

2.5.2 mTOR下游蛋白P70s6k、4E-BP1和eIF4E表达及其磷酸化水平的变化 与对照组比较，当H2O2浓度为25～100 μmol/L时，mESCs细胞总P70s6k蛋白表达差异无显著性（P ＞0.05），但H2O2浓度为150～200 μmol/L时，其表达显著低于对照组（P ＜ 0.05）；总4E-BP1和总eIF4E蛋白表达在H2O2浓度为25～150 μmol/L时，均显著高于对照组（P ＜0.05或P ＜0.01），而H2O2浓度为200 μmol/L时，其表达水平接近对照组水平(图7)。

图7 Western Blot检测低浓度H2O2刺激诱导mESCs细胞P70s6k、4E-BP1和eIF4E总蛋白表达的变化

在H2O2浓度为25～150 μmol/L时，p-P70s6k的表达水平呈逐渐增加趋势且显著高于对照（P＜0.05或P＜0.01），同样p-4E-BP1和p-eIF4E蛋白表达也显著高于对照（P ＜0.05或P＜0.01），提示此浓度范围内，H2O2显示出对AKT/mTOR信号通路有活化作用。而当H2O2浓度为200 μmol/L时，3个磷酸化蛋白的表达水平均分别低于对照组（P＜0.05或P ＜0.01），提示此浓度H2O2对细胞AKT/mTOR信号通路具有显著抑制效应（图8）。

图8 Western Blot检测低浓度H2O2刺激诱导mESCs的p-P70s6k、p-4E-BP1和p-eIF4E蛋白表达的变化

2.6 MTT法检测低浓度H2O2和雷帕霉素刺激对mESCs增殖的影响 为了进一步探讨低浓度H2O2对mESCs的促增殖作用是由AKT/mTOR信号通路活化所介导，我们通过mTOR蛋白抑制剂雷帕霉素与H2O2共同作用于mESCs，观察其生长情况。结果显示：单独雷帕霉素（50 ng/ml）刺激细胞能显著抑制细胞增殖（P ＜0.01），当细胞同时受到不同浓度H2O2和50 ng/ml 雷帕霉素共同作用48 h后，与单独各浓度H2O2刺激比较，mESCs的增殖明显被抑制（P＜0.05或P＜0.01）。提示雷帕霉素能抑制低浓度H2O2诱导的mESCs增殖作用, H2O2诱导的mESCs增殖可能是通过Akt /mTOR信号通路介导。(图9)。

2.7 Western Blot检测低浓度H2O2对细胞增殖周期相关蛋白表达的影响 进一步观察H2O2诱导的细胞增殖相关蛋白Cyclin D1和PCNA的表达变化，结果显示，50 μmol/L H2O2诱导能显著诱导mESCs表达Cyclin D1和PCNA（P＜0.05或P＜0.01），雷帕霉素则抑制其表达（P ＜0.05）；同时加入H2O2和雷帕霉素处理细胞，与单独50 μmol/L的H2O2作用相比，Cyclin D1和PCNA的表达显著降低，提示mTOR 蛋白抑制剂雷帕霉素能显著抑制H2O2诱导的细胞增殖相关蛋白的表达，进一步证实H2O2诱导的mESCs增殖可能是通过活化Akt /mTOR信号通路介导(图10)。

图9 MTT法检测mTOR 蛋白抑制剂雷帕霉素(RAPA)对H2O2诱导的mESCs增殖反应的抑制作用

图10 Western Blot检测mTOR 蛋白抑制剂雷帕霉素（RAPA）对H2O2诱导的mESCs增殖相关蛋白Cyclin D1和PCNA表达的影响

3 讨 论

临床实践发现适当浓度范围的H2O2不仅能有效杀灭细菌，而且还能促进创面愈合[1-2,8]，但其促愈机制尚不清楚。

H2O2是细胞内主要的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）产物之一，研究证实细胞内适当水平的ROS是维持干细胞、内皮细胞生长、迁移的前提[9-10]。有研究证实，低浓度的ROS被证实具有生长因子样作用的特性，低水平的H2O2和O2-能够增加静止细胞DNA的合成和诱导细胞c-fos和 c-myc基因表达上调，而这些基因都与细胞增殖相关[6]；此外，H2O2作为一种膜易透性、小分子化合物，能刺激细胞内多个信号通路发挥更为重要的信号转导和信使分子的作用[11]，在生长因子诱导的内皮细胞（EC）迁移过程中，受体的活化能诱导H2O2的产生，引起EC内H2O2产生和蓄积而作为一种有效的信号转导分子[2-4]；外源性H2O2能诱导EC内信号级联反应的活化[6-7]。因此，适当浓度的H2O2对于维持EC存活、生长和迁移以及促进血管生成都是必需的。这可能是低浓度H2O2促愈机制之一。

mESCs是维持皮肤新陈代谢的主要功能细胞，也是皮肤创伤修复发挥着重要作用的效应细胞。由于低浓度H2O2具有创面促愈效应[1-3,8]，因此，本研究探讨低浓度H2O2对mESCs增殖的影响，以进一步阐明其促愈机制。

我们通过酶消化法分离获得小鼠mESCs，相差显微镜下观察其呈克隆性生长，细胞体积小，核质比大，包内细胞器稀少。通过流式细胞术和免疫荧光检测结果提示分离培养的细胞是皮肤表皮干细胞。

本研究发现低浓度的H2O2(25 μmol/L和50 μmol/L)作用48和72h后，能显著促进mESCs增殖，但当H2O2浓度增加到150和200μmol/L时，则显示细胞生长抑制。由此提示低浓度H2O2对表皮干细胞有促增殖作用。由于Akt/mTOR 信号通路在细胞生长中处于核心地位，它参与调控细胞生长、细胞周期和DNA损伤修复等过程，为了阐明低浓度H2O2对mESCs的促增殖作用是否依赖于Akt/mTOR信号通路的活化，我们在细胞培养体系中同时加入mTOR蛋白抑制剂雷帕霉素，结果显示雷帕霉素能对抗H2O2诱导的mESCs的增殖效应，由此提示H2O2促进mESCs细胞增殖可能依赖于Akt/mTOR信号通路的活化。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是感受营养信号、在调节细胞生长与增殖中起着关键作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，活化的mTOR促进其下游信号分子P70s6k和4E-BP1的磷酸化活化，进而引起真核翻译起始因子（the eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E）磷酸化活化，最终导致促进靶蛋白的翻译起始[5-6]。有研究表明，mTOR是维持皮肤内环境稳定的关键信号通路，同时也是维持细胞生长、代谢和血管发生的重要调控元件[5]。为此，我们进一步观察了低浓度H2O2对Akt/mTOR信号通路关键蛋白的表达与磷酸化活化的影响,结果提示,低浓度H2O2（25～100 μmol/L）能显著上调Akt/mTOR信号通路关键蛋白如Akt、mTOR、P70s6k、4E-BP1和eIF4E的表达及其磷酸化水平，促进了此信号通路的活化。由于此通路参与了细胞增殖相关蛋白的表达调控，与细胞增殖周期关系密切，进一步检测结果提示，在低浓度H2O2作用下，伴随着Akt/ mTOR信号通路的活化，细胞周期蛋白cyclin D1和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表达也明显上调，而雷帕霉素能对抗H2O2诱导的cyclin D1和PCNA表达的上调，进一步提示H2O2促表皮干细胞增殖依赖于Akt/mTOR信号通路的活化。

上述实验数据表明，低浓度H2O2的促愈效应的机制之一，可能是通过促进表皮干细胞的增殖而实现，而低浓度H2O2促表皮干细胞增殖的活性则依赖于AKT/mTOR信号通路的活化。

［1］Niethammer P, Grabher C, Look AT, Mitchison TJ. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish[J]. Nature, 2009，459: 996–999.

［2］Schreml S, Landthaler M, Schaferling M, Babilas P. A new star on the H2O2rizon of wound healing? [J]. Exp Dermatol,2011,20: 229–231.

［3］Park SK, Kim J, Seomun Y, Choi J, Kim DH, Han IO, Lee EH, Chung SK, Joo CK. Hydrogen peroxide is a novel inducer of connective tissue growth factor[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 284:966-971.

［4］Plikus MV, Gay DL, Treffeisen E, Wang A, Supapannachart RJ, Cotsarelis G. Epithelial stem cells and implications for wound repair[J]. Semin Cell Dev Biol, 2012, 23(9): 946-953.

［5］Clark RA, Pavlis M. Dysregulation of the mTOR pathway secondary to mutations or a hostile microenvironment contributes to cancer and poor wound healing[J]. J Invest Dermatol, 2009,129:529-531.

［6］Wullschleger S, Loewith R, Hall MN. TOR signaling in growth and metabolism[J]. Cell, 2006,124:471-484.

［7］Blagosklonny MV. Aging: ROS or TOR[J]. Cell Cycle, 2008,7(21):3344-3354.

［8］Mohammadi AA, Jafari SMS, Kiasat M, Pakyari MR, Ahrari I. Efficacy of debridement and wound cleansing with 2% hydrogen peroxide on graft take in the chronic-colonized burn wounds; a randomized controlled clinical trial[J]. Burn, 2013,39:1131-1136.

［9］Lekli I, Gurusamy N, Ray D, Tosaki A, Das DK. Redox regulation of stem cell mobilization[J]. Can J Physiol Pharmacol, 2009,87: 989–995.

［10］Pervaiz S, Taneja R, Ghaffari S. Oxidative stress regulation of stem and progenitor cells[J]. Antioxid Redox Signal, 2009,11:2777–2789.

［11］Rhee SG. Cell signaling: H2O2, a necessary evil for cell signaling[J]. Science, 2006, 312: 1882–1883.

Akt/mTOR pathway mediates the proliferation of murine epidermal stem cells following low concentration of hydrogen peroxide treatment

Qi Junhua*, Nie Gang, Wu Mei, Liu Xiaoping, Chen Minjia, Zhu Ming, Yuan Peisong, Zhang Ya , Song Yuqing, Guo Wei, Xing Wei, Li Xiangyun, Luo Donglin, Huang Hong, Xu Xiang.
*State Key Laboratory of Trauma, Burn and Combined Injury, Institute of Surgery Research, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400042, China

Huang Hong(E-mail:huanghongcq@163.com)

Objective:To investigate the effect of a low concentration of hydrogen peroxide (H2O2) on the proliferation of murine epidermal stem cells (mESCs) and its mechanism. Methods: The mESCs were isolated with trypsin and type I collagen enzyme digestion. The mESCs were identified using β1 integrin, keratin 19 (K19) and CD34 antibody with immunofluorescence detection technique and flow cytometry analysis. The mESCs were treated with different concentrations of H2O2(0, 25, 50, 100, 150 and 200 μmol/L) for 48 hours and 72 hours, and in another experiment, the mESCs were treated with low concentrations of H2O2(0, 25, 50, 100, 150 μmol/L) alone or combined with 50 ng/ml rapamycin (Rapa) for 48 hours. The proliferation of mESCs was detected by MTT analysis, and the expression of key proteins such as mTOR, Akt, P70s6k, eIF4E,4E-BP1, p-Akt, p-mTOR, p-P70s6k,p-4E-BP1 and p-eIF4E in the Akt/mTOR signaling pathway was assayed using Western blotting after mESCs treated with different concentrations of H2O2for 48 hours. The expression of cell cycle protein cyclin D1 and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) were also determined using Western blotting. Results: The results showed that 100% of the mESCs expressed β1 integrin and K19， and 99.8% of them expressed CD34, thereby mESCs were comfirmed. The proliferation of mESCs was makedly increased 48 and 72 hours after H2O2treatment at the dose of 25 μmol/L and 50 μmol/L（P ＜0.05）, and this proliferation effect as induced by H2O2was antagonized by rapamycin. However, the proliferation of mESCs was inhibited markedly after treatment with 200 μmol/L H2O2for 48 hours and 72 hours (P ＜0.05), Furthermore, after mESCs were treated with H2O2in a concentration of 25 μmol/L to 150 μmol/L, the Akt/mTOR pathway was activated, characterized by a marked increase of expression of total and phosphorylated key proteins ( p-mTOR, p-4E-BP1 and p-eIF4E) in this pathway(P ＜0.05 or P ＜0.01), but the expression of these proteins was dramatically attenuated after being treated with 200 μmol/L of H2O2(P ＜0.05 or P ＜0.01). In addition, the expression of cell cycle protein cyclin D1 and PCNA were increased (P＜0.05) after being treated with 50 μmol/ L H2O2, and it was antagonized by treatment of rapamycin. Conclusions: Low concentration of H2O2can promote the proliferation of mESCs, and it activates the Akt/mTOR pathway. The mESCs proliferation induced by low concentration H2O2is partly dependant on the Akt/mTOR pathway activation.

Epidermal stem cells Hydrogen peroxide The Akt/mTOR pathway Proliferation

10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2015. 03. 003

Xu Xiang(E-mail:xiangxu@ymail.com)

2015-04-03)

国家自然科学基金面上项目 （81372059，81372060）; 国家重点基础研究发展规划项目(2012GB518105)

黄宏，教授（E-mail: huanghongcq@163.com）; 徐祥，教授（E-mail:xiangxu@ymail.com）