椎板切除神经根损伤后聚羧甲基葡萄糖胺产品抗瘢痕粘连的效果①

苏迪娅，刘松，王世炜，历俊华，崇逢，李东风，李睿智，万虹

椎板切除神经根损伤后聚羧甲基葡萄糖胺产品抗瘢痕粘连的效果①

苏迪娅1，刘松1，王世炜1，历俊华1，崇逢2，李东风2，李睿智2，万虹1

目的探索聚羧甲基葡萄糖胺产品防止神经损伤后瘢痕粘连形成的效果。方法48只雄性Sprague-Dawley大鼠分为A、B两组。大鼠切除L4-5椎板，暴露并损伤右侧神经根。A组术区涂抹生理盐水，B组涂抹聚羧甲基葡萄糖胺产品。术后第1 (A1、B1)、2(A2、B2)、4周(A3、B3)对各组神经根周围粘连行Rydell评分；HE染色、Masson染色观察，行粘连组织学Nussbaum评分；检测血常规和肝、肾功能。结果各组Rydell评分：A1组Ⅰ级、A2组Ⅱ级、A3组Ⅲ级，B1组0级、B2组0级、B3组Ⅱ级。HE染色示B组较A组神经根周围粘连速度慢且瘢痕生长疏松。Masson染色示B组较A组神经根周围瘢痕组织网稀疏散在，且随时间延长其致密程度加深不明显。组织学Nussbaum评分示，同时段A、B组间比较均有显著性差异(P＜0.05)。各组大鼠血常规及肝、肾功能均在正常参考值范围内。结论聚羧甲基葡萄糖胺产品能有效防止椎板切除术后神经根周围及硬膜外瘢痕粘连形成，无毒副作用。

聚羧甲基葡萄糖胺；椎板切除术；神经根；瘢痕；粘连；大鼠

[本文著录格式]苏迪娅，刘松，王世炜，等.椎板切除神经根损伤后聚羧甲基葡萄糖胺产品抗瘢痕粘连的效果[J].中国康复理论与实践,2015,21(1):45-48.

CITED AS:Su DY,Liu S,Wang SW,et al.Effect of a chitosan product on scarring and adhesion of injured nerve after laminectomy[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(1):45-48.

椎板切除术是脊柱外科常用的术式之一。椎板切除术后，在椎板缺损处可形成瘢痕组织，与硬膜及神经根周围粘连，最终压迫、牵拉神经根而引起腰腿疼痛，严重影响手术的长期效果，同时为再次手术增加了困难和风险。我们依据聚羧甲基葡萄糖胺的理化性质和瘢痕形成原理，观察聚羧甲基葡萄糖胺产品对椎板切除术后抗瘢痕粘连的效果，探讨聚羧甲基葡萄糖胺产品在神经外科领域中抗瘢痕粘连的有效性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及设备

聚羧甲基葡萄糖胺产品由北京爱美客生物科技有限公司提供。K型电子天平：美国双杰兄弟有限公司。AXTOV-mRC数字信号采集分析系统：尼康影像仪器销售有限公司。RM2235手动轮转式切片机、M400-E手术显微镜、EG1150H加热石蜡包埋系统：德国LEICA公司。Masson染色试剂盒：北京益利精细化学品有限公司。

成年雄性Sprague-Dawley大鼠48只，体重200～220 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。

1.2 模型制作及动物分组

实验动物称重，戊巴比妥0.1 ml/100 g腹腔注射麻醉。大鼠取俯卧位，固定头部及四肢，腹部垫棉垫使脊柱轻度背弓。背部术区备皮，0.5%碘伏消毒。铺无菌洞巾。触摸肋弓定位，以L4棘突为中心，作脊柱正中切口，长约5.0 cm，切开皮肤、背部筋膜，钝性剥离骶棘肌，暴露L4-5椎板，自上而下切除L4-5椎板，暴露并损伤硬脊膜及同节段右侧神经根，压迫止血。

动物分为两组：A组以棉片浸透生理盐水，B组以聚羧甲基葡萄糖胺产品涂抹在神经根和硬脊膜表面。A组3 min后取出棉片，以生理盐水冲洗切口3次；B组待液态聚羧甲基葡萄糖胺凝聚为胶体状态后，逐层缝合手术切口。术后动物按组分笼饲养。所有大鼠术前、术后喂养及管理条件一致。根据观察时间不同，A、B两组又各分为3个亚组(n=8)：A1组与B1组为术后1周观察组、A2组与B2组为术后2周观察组、A3组与B3组为术后4周观察组。

1.3 Rydell评分

术后每天观察动物的活动情况。在术后1、2、4周取相应亚组内3只大鼠戊巴比妥0.1 ml/100 g腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛灌注，完整切取手术节段脊柱，观察硬膜外粘连情况。参考Rydell等制定的评分标准[1]，将硬膜外及神经根周围粘连程度分为4级：0级，硬膜和神经根与瘢痕组织或移植物无明显粘连；Ⅰ级，硬膜和神经根外有稀疏而散在的膜性粘连，瘢痕组织或填充物易与硬膜钝性分离；Ⅱ级，硬膜和神经根与瘢痕组织粘连较广泛和致密，钝性分离阻力较大，分离后硬膜仍保持完整；Ⅲ级，粘连广泛、致密，硬膜和神经根与瘢痕无法钝性分离，锐性分离后的硬膜难以保持完整。进行Rydell评分。

1.4 标本制备

术后1、2、4周，取相应亚组内5只大鼠，戊巴比妥0.1 ml/100 g腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛心脏灌注，完整切取手术节段脊柱，4%多聚甲醛室温固定24 h，30%甲酸室温脱钙5 d，清水冲洗1 d后浸蜡，包埋，石蜡切片，片厚4 μm。选取邻片分别进行HE染色与Masson染色。

1.5 HE染色

石蜡切片脱蜡入水，染色，脱水透明，封片。由3名对分组情况不知情的专业人员对各组粘连程度按照改良Nussbaum标准[2]进行组织学评分：0分，无粘连；1分，少量粘连；2分，中量粘连；3分，大量粘连。

1.6 Masson染色

石蜡切片脱蜡入水，染色，先入苏木精染液，盐酸酒精分色后用Masson染色盒进行4种染液(丽春红-酸性复红液、磷钼酸溶液、亮绿溶液、冰醋酸水溶液)逐一滴染，脱水、透明、封片，显微镜下观察。

1.7 血常规及肝、肾功能检测

每组分别取5只大鼠，戊巴比妥0.1 ml/100 g腹腔注射麻醉，真空采血管心脏取血3 ml，送检验科检测肝肾功能和血常规。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 Rydell评分

A1组有稀疏而散在的膜性粘连，Rydell评分Ⅰ级；B1组未见纤维粘连，未形成瘢痕组织，Rydell评分0级。A2组瘢痕粘连较A1组有所增加，硬膜与瘢痕组织粘连较广泛和致密，钝性分离阻力较大，分离后硬膜仍保持完整，Rydell评分Ⅱ级；B2组未见明显纤维粘连，Rydell评分0级。A3组有明显纤维瘢痕粘连，用利器难以分离，Rydell评分Ⅲ级；B3组硬膜外有稀疏而散在的膜性粘连，瘢痕组织或填充物易与硬膜钝性分离，Rydell评分Ⅱ级(图1)。

2.2 HE染色

光镜下神经组织与瘢痕纤维均呈粉红色，细胞核蓝染。A1组神经根与脊髓表面粘连少量而松散；B1组神经根表面基本无粘连。A2组神经根与脊髓表面粘连较A1组稍致密，但致密度不高；B2组神经根与脊髓表面粘连少量而松散。A3组神经根周围可见致密纤维组织包裹；B3组神经根与脊髓表面粘连有稀疏的纤维组织(图2)。A组和B组同时段大鼠神经根与脊髓周围的粘连程度Nussbaum评分均存在显著性差异

(P＜0.05)。见表1。

2.3 Masson染色

脊髓组织与神经根组织呈红色，瘢痕组织呈蓝绿色。与邻片HE染色同时观察，A1组神经根与脊髓表面粘连少量，可见蓝绿色粘连呈网状，且网状结构较松散；B1组神经根表面基本无粘连。A2组神经根与脊髓表面粘连较A1组稍致密，网状结构中白色部分明显减少；B2组神经根与脊髓表面粘连少量而松散，绿色粘连呈絮状结构。A3组神经根周围可见致密纤维组织包裹；B3组神经根与脊髓表面有稀疏的绿色网状结构(图3)。

表1 术后各组瘢痕粘连程度Nussbaum评分比较

图1 各组大体解剖学观察(25×)

图2 各组HE染色观察

2.4 血常规及肝、肾功能检测

各组大鼠的血常规及肝、肾功能检测值均在正常范围内。见表2。

表2 各组血常规及肝肾功能比较

3 讨论

椎板切除术是脊柱外科常见的术式之一，常用于腰椎间盘突出症、脊柱肿瘤和椎管减压等。术后在伤区会发生一系列复杂的生物学反应：细胞浸润，中性粒胞聚集，巨噬细胞数量增多，成纤维细胞合成胶原与基质量增加，早期为肉芽组织，晚期形成瘢痕。

对于椎板切除后瘢痕粘连成因说法多样，得到最多认可的是Songer等提出的“三维立体学说”[3]。他们研究发现，硬膜周围的纤维化既来自后方损伤的骶棘肌，也来自前方损伤的纤维环和后纵韧带。还有研究认为，纤维化形成过程中，血肿和炎症反应也起到非常重要的作用。根据以上理论，我们认为，三维立体包绕神经根及硬膜，使它们与周围组织达成某种程度物理隔离，同时又存在抗炎、止血效果的抗瘢痕粘连产品效果最佳。

聚羧甲基葡萄糖胺又名羧甲基壳聚糖，具有抑制成纤维细胞生长并减少胶原纤维合成的作用。此外，聚羧甲基葡萄糖胺还具有一定的生物活性，如止血[4]、抗感染[5]、提高免疫活性、减少瘢痕组织形成[6]等。聚羧甲基葡萄糖胺的降解产物主要为羧甲基葡萄糖胺，安全、无毒副作用[7]。

本实验中由北京爱美客生物科技有限公司提供的聚羧甲基葡萄糖胺产品还具有独特的生物学优势。此产品由双联注射器和封装在双联注射器中的溶液组成。双联注射器中溶液主要由聚羧甲基葡萄糖胺及双重交联剂配制而成。双联注射器中溶液经双联注射器推出，混合均匀后，混合溶液初始呈流动状态，且具有一定黏附性；在化学、物理双交联作用下，可在40 s内原位形成凝胶膜。该凝胶柔软而有弹性，且具有一定的抗压能力及拉伸强度，符合防粘连材料的临床要求；凝胶pH值及渗透压均接近体内组织环境，符合防粘连材料的安全性要求；凝胶仍保留聚羧甲基葡萄糖胺抑制成纤维细胞生长并减少胶原纤维合成的作用，符合防粘连材料的生物活性要求。不会发生失水，溶胀性较小，且溶胀后仍保持柔软状态，不影响效果；成胶阻隔效果不受组织液及血液存在的影响；凝胶膜柔软有弹性，不会压迫神经；凝胶膜具有一定的抗压能力及拉伸强度，不会因组织缝合过程中的牵拉而断裂，不会因组织间的压力而碎裂。

本研究显示，此聚羧甲基葡萄糖胺产品可有效防止椎板切除术后瘢痕粘连形成，对实验动物无毒副作用。该产品操作简单、便捷，有望成为临床有效、实用的抗神经粘连产品。

[1]Rydell N,Balazs EA.Effect of intra-articular injection of hyaluronic acid on the clinical symptoms of osteoarthritis and on granulation tissue formation[J].Clin Orthop Relat Res,1971, 80:25-32.

[2]Nussbaum CE,McDonald JV,Baggs RB.Use of Vicryl(polyglactin 910)mesh to limit epidural scar formation after laminectomy[J].Neurosurgery,1990,26(4):649-654.

[3]Songer MN,Ghosh L,Spencer DL.Effects of sodium hyaluronate on peridural fibrosis after lumbar laminotomy and discectomy[J].Spine(Phila Pa 1976),1990,15(6):550-554.

[4]Rajiv S,Harding M,Bassiouni A,et al.The efficacy and safety of chitosan dextran gel in a burr hole neurosurgical sheep model[J].Acta Neurochir(Wien),2013,155(7):1361-1366.

[5]叶磊,何立千,高天洲,等.壳聚糖的抑菌作用及其稳定性研究[J].北京联合大学学报:自然科学版,2004,18(1):79-82.

[6]曾德强,陈双,杨斌.壳聚糖膜预防术后腹腔粘连及其作用机制的研究[J].岭南现代临床外科,2005,5(2):94-96.

[7]Kean T,Thanou M.Biodegradation,biodistribution and toxicity of chitosan[J].Adv Drug Deliv Rev,2010,62(1):3-11.

Effect of A Chitosan Product on Scarring and Adhesion of Injured Nerve after Laminectomy

SU Di-ya,LIU Song,WANG Shi-wei,LI Jun-hua,CHONG Feng,LI Dong-feng,LI Rui-zhi,WAN Hong.Beijing Neurosurgical Institute,Beijing Tiantan Hospital of Capital Medical University,Beijing 100050,China

Objective To investigate the effects of a chitosan product on scarring and adhesion after never injury in laminectomy in rats. Methods 48 male Sprague-Dawley rats were divided into group A and group B,and carried laminectomy of L4-5,and injured the right spinal nerve roots.The normal saline was smeared on the operation field in the group A,while the chitosan product was smeared in the group B. The adhesion was assessed with Rydell score 1(groups A1/B1),2(groups A2/B2)and 4(groups A3/B3)weeks after operation,while the spinal nerves were observed with HE staining and Masson staining,and the adhesion was assessed with Nussbaum score.The complete blood count and the series of blood chemistries and enzymes for liver and kidney functioning were measured.Results The Rydell scores of adhesion was I grade in group A1,II grade in A2 and III grade in A3,while was 0 grade in B1,0 grade in B2 and II grade in B3.The scar and adhesion contact more loosely in the group B than in the group A,and the Nussbaum score was less in the group B than in the group A at the same time(P＜0.05).The complete blood count and the series of blood chemistries and enzymes for liver and kidney functioning were in normal.Conclusion This chitosan product can prevent the formation of epidural scar and adhesion around the spinal and the nerve roots after laminectomy,with little toxicity and side effects.

chitosan;laminectomy;nerve roots;scar;adhesion;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.01.012

R651.2

A

1006-9771(2015)01-0045-04

2014-07-24

2014-08-22)

国家自然科学基金项目(No.31440051)。

1.首都医科大学北京市神经外科研究所损伤修复室，北京市100050；2.北京爱美客生物科技有限公司，北京市100022。作者简介：苏迪娅(1987-)，女，汉族，辽宁大连市人，硕士研究生，主要研究方向：周围神经损伤。通讯作者：万虹(1963-)，女，汉族，吉林长春市人，博士，主要研究方向：神经系统损伤修复。E-mail:wanhong96@163.com。