KLKs基因表达对卵巢癌恶性度评估初探

曾照成，王晓玫

1.暨南大学第二临床医学院肿瘤内科，广东深圳 518001；2.暨南大学第二临床医学院病理科，广东深圳 518001

卵巢癌在妇科肿瘤中死亡率居首位，当前卵巢癌患病率呈逐年上升趋势。由于卵巢癌的发病隐匿，所以找寻卵巢癌发病过程中的敏感及特异肿瘤标志物极有可能为为卵巢癌临床诊治和转归提供有价值的生物指标[1]。已有研究表明人类组织激肤释放酶家族(Human kailikrein, KLK)于肿瘤发生发展多个过程中都有参与[2]，为研究激肽释放酶（kallkarein)KLK10 及KLK11 在卵巢癌组织中的表达，现分析2008年1月— 2013年12月在该院行卵巢手术且资料完整患者75例的临床资料，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2008年1月—2013年12月在暨南大学第二临床深圳市人民医院行卵巢手术且资料完整患者共75例为研究以对象，患者均为初次接受手术治疗,术前未行放疗、化疗及其他药物治疗。

实验分组:良性肿瘤组：卵巢良性上皮肿瘤组织32例，正常卵巢组织18例。卵巢癌组织43例。病理类型：在全部卵巢癌组中恶性肿瘤占43例，年龄40~70 岁。手术分期是：恶性肿瘤组别，Ⅰ期5例，Ⅱ期11例，Ⅲ期18例，Ⅳ期9例。

1.2 试剂和方法

KLK10，KLK11 兔抗人单克隆抗体购自美国RD 公司，二抗购自美国罗氏公司，DAB 购自美国罗氏公司。

采用免疫组化LDp 法，抗KLKn 的单抗工作浓度均为1:25。①常规切片脱蜡浸水，通过3%过氧化氢阻断内源性组织过氧化物酶；②10 min 后室温下进行高压抗原修复；③HarriS 苏木淡染精细胞核l min，洗片用流水，添加PBS 缓冲液；④加抗KLKll 单抗(工作浓度1:25)，4 ℃过夜；⑤第二日用PBS 缓冲液以冲洗切片3 次，5 min/次； ⑥加Envision TM 试剂,37 ℃孵 箱 内20 min；⑦PBS 冲洗3 次，5 min/次；⑧DAB/H2O2显色，于光镜下进行控制，纯水对呈色反应进行终止；⑨常规脱水到封片。选择已知的阳性组织切片作为阳性对照，以PBS 替代抗KLKn 单抗以作空白对照。

1.3 观察指标

Klk10,11 免疫组化结果和Klk10,11 的定量表达情况。

1.4 评价指标

所有患者KLKll，KLK10 免疫组化的结果：如果在细胞胞核及胞质中出现棕黄色的反应物即判定为阳性表达。依据切片中的阳性细胞数及细胞阳性百分比将结果区分为:无表达(-):检测切片当没有阳性细胞;少量表达(+):检测切片中阳性细胞<25%;一般表达(++):检测切片中阳性细胞数≥25%、<50%;大量表达(+++):检测切片中阳性细胞≥50%。

1.5 统计方法

采用SPSS 19.0 统计学软件对数据进行分析和处理，染色反应灰度值采用均数±标准差（±s）表示，两组间的均数比较行t 检验，多个样本间的均数行单因素方差分析，klk10,11 表达同卵巢癌的恶性程度评估分析使用χ2检验。

2 结果

2.1 Klk10,11 免疫组化结果

研究结果显示：KLK11 都表达于健康卵巢、卵巢良性肿瘤、卵巢癌上皮组织细胞的胞质与胞核。但根据数据可以看出，卵巢癌组织中klk11 的表达明显不如正常卵巢组织，差异有统计学意义（P<0.05）； 卵巢良性肿瘤组织中klk11 的表达与正常卵巢组织klk11 的表达差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 各组卵巢组织中klk11 的表达

由结果可以看出，Ⅰ/Ⅱ卵巢癌组织中的klk11 表达阳性率显著高于Ⅲ/Ⅳ期卵巢癌组织中的klk11 表达阳性率，结果差异有统计学意义（P<0.05）；G1 级卵巢癌组织中的klk11 表达阳性率和G2/G3 级卵巢癌组织中的klk11 表达阳性率差异无统计学意义（P>0.05）；不同组织学类型的卵巢癌组织中的klk11 表达阳性率存在着显著差异，结果差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 卵巢癌组织中KLK11 表达与其临床病理参数的关系

2.2 卵巢癌KLK10 与KLK11 表达定量分析

Klk11 于卵巢癌组织中的表达比它在正常的卵巢组织和良性的卵巢肿瘤组织表达的水平要低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1；Klk10 于卵巢癌组织中的表达比它在正常的卵巢组织和良性卵巢肿瘤组织表达的水平要低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 各组卵巢组织中KLK10 的表达

3 讨论

人类组织的激肽释放酶基因(human tissue kallikreins gene，KLKs) 是一组高度保守的基因簇，在肿瘤组织中差异性表达。KLKs 的生物学功能主要通过其表达产物人类组织激肽释放酶发挥作用[3]。

该研究应用免疫组化方法对KLK11、KLK10 于卵巢癌、卵巢的良性肿瘤和卵巢的正常组织当中表达情况进行研究。研究结果表明： ①KIKll 与KLK10 蛋白hKn 于卵巢上皮的细胞当中均有表达； ②KIKll 与KLK10 蛋白hKn 表达水平同卵巢细胞良恶性相关，它们于卵巢癌组织中的表达比在正常的卵巢组织和良性的卵巢肿瘤组织中表达要低 {KLK11 （P=0.044）KLK10 (P=0.002)}；③KLK11 与KLK10hKn 表达水平同卵巢癌临床分期相，在最初卵巢癌组织中(Ⅰ/Ⅱ期)KLK11 和KLK10hKn 的表达水平明显优于晚期的卵巢癌(Ⅲ/Ⅳ期){KLK11(P=0.010), KLK10(P=0.032)； ④KLKll 与KLK10hKn 的表达水平和卵巢癌组织学类型有关，KLKll 与KLK10hKll 在浆液性的卵巢癌组织中的表达与其他卵巢癌的组织类型相比有显著升高(KLK11:P=0.003，KLK10:P=0.003)。这与已有的研究结果相类似[4]。

综上所述，KLK10 和11 有望成为早期诊断卵巢癌的血清标志物，考虑到KLK 群的生物学特点，对它的检测对于卵巢癌和其他类型播散性肿瘤的区分十分有益。

[1]Kang WD，Choi HS，Kim SM.value of serum CA125 levers in patients with high-risk,early stage epithelial ovarian cacer[J].Gynecol Oncol，2010，116（1）:57-60.

[2]Evans DG，Gaarenstroom KN，Stirling D.Screening for familial ovarian cancer:poor survival of BRCA1/2 related cancer[J].J Med Genet，2009，46（9）:593-597.

[3]苏晓峰.Kallikrein7 基因在胃癌中的表达及其siRNA 对胃癌细胞增殖的影响[D].上海：第二军医大学,2012.

[4]王焕春.KLK5 在乳腺癌中的表达及其靶向microRNA 的预测和验证[D].泰安：泰山医学院,2012.

[5]李利文.KLK15 基因在甲状腺肿瘤中的表达和意义[D].郑州：郑州大学,2013.

[6]褚芳波,陈英剑,胡成进，等.人类组织肽释放酶在卵巢癌中的表达及意义[J].国际肿瘤学杂志,2014(8):608-611.

[7]李磊.Kallikrein10 的调控机制及其肿瘤临床应用的价值[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2014,21(1):109-113.

[8]吴艳花.人组织激肽释放酶5 抗体制备及双抗体夹心ELISA 检测方法的建立[D].泰安：泰山医学院,2012.