应用组织特异微RNA构建更加安全的腺病毒

王荣花(综述)，王慧萍(审校)

(上海交通大学附属第一人民医院实验中心，上海 200080)

应用组织特异微RNA构建更加安全的腺病毒

王荣花(综述)，王慧萍※(审校)

(上海交通大学附属第一人民医院实验中心，上海 200080)

摘要：溶瘤腺病毒是目前最有潜力的肿瘤治疗病毒载体之一，但其在应用过程中会产生比较严重的毒副作用，特别是肝脏毒性。为了更好地针对组织靶标，需要制备更加安全、有效的溶瘤腺病毒。近年来，科学家使用微RNA(miRNA)调控基因表达系统，将若干拷贝数的组织特异性miRNAs对应的靶序列加入到腺病毒复制早期必需基因E1基因表达盒的3′非翻译区，在转录后水平调控病毒复制。这种方法能有效消除腺病毒的毒副作用，进一步提高腺病毒使用的安全性。

关键词：肿瘤；腺病毒；微RNAs

1985年，Ballay等[1]首次使用腺病毒作为基因载体。自此，腺病毒应用于肿瘤基因治疗的研究迅速开展起来。腺病毒的理化性质稳定，且容易制备纯化，病毒滴度高，插入的外源基因片段长，可感染处于不同周期的细胞，转染效率高，且无致突变的危险，尤其适用于肿瘤的基因治疗，这些优点使其成为目前应用最为广泛的病毒载体之一[2]。

早先开发的复制缺陷型腺病毒载体在体内无增殖能力，容易被机体清除，这使得治疗基因在体内表达时间相对较短，治疗效果较弱。而目前广泛使用的条件复制型腺病毒(conditionally replicating adenovirus，CRAd)载体能克服这些缺点，其能够选择性地在肿瘤细胞内复制增殖并散播至更多的肿瘤细胞，有更强的肿瘤清除能力和更低的毒性[3]。构建CRAd的方法主要是在不同阶段调控腺病毒复制早期必需基因的表达。现对应用组织特异性微RNA(microRNA,miRNA)靶序列构建的CRAd予以综述。

1腺病毒复制的调控

1.1转录前水平的调控 在转录前使腺病毒复制早期基因E1a/E1b突变或缺失可使腺病毒只在特定细胞中复制，如onyx-015可使E1b-55k基因缺失，从而不能编码与p53结合的p105蛋白，使得其只能在p53功能缺陷的肿瘤细胞中复制[4]；Δ24腺病毒可在E1a的CR2区造成24 bp大小的碱基缺失突变，导致不能正常编码Rb结合蛋白，因此腺病毒只能在Rb功能缺失的肿瘤细胞中选择性复制[5]。

1.2转录水平的调控 在转录水平通常是使用一些特异性启动子对腺病毒复制早期必需基因进行调控，如CN706使用前列腺特异性抗原基因增强子元件启动子调控5型腺病毒复制早期必需基因E1A，使腺病毒只在表达前列腺特异性抗原的前列腺肿瘤细胞中复制[6]。CNHK500采用人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcript，hTERT)启动子调控E1A基因、采用缺氧反应元件(hypoxia response element，HRE)启动子调控E1B基因共同构建双靶向条件增殖型腺病毒，使病毒的复制能更好地控制在具有高hTERT活性及高HRE活性的肿瘤细胞中[7]。

1.3转录后水平的调控 转录后调控主要是将组织特异性miRNA靶序列插入到腺病毒复制早期必需基因的3′非翻译区(untranslated region，UTR)，调控病毒复制早期必需基因的特异性表达，进而达到调控腺病毒特异性复制的目的。

2组织特异性miRNA

1993年，在研究线虫突变表型时第1次发现miRNA line-4 和let-7通过调控靶基因的翻译调控胚胎的发育。利用突变体研究技术，越来越多的miRNA在包括人类、果蝇及植物等多种生物中发现[8-9]。miRNA在细胞生长、增殖、分化、凋亡及细胞信号网络、基因调控网络中发挥着重要的调节作用[10]。

miRNA是高度保守的小的非编码RNA，大约22个核苷酸长度，调控着约30%的人类基因[11]。在转录和加工后，成熟的miRNA的一条链形成一个RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，然后成熟的miRNA引导RISC与目的信使RNA(messenger RNA,mRNA)的部分碱基完全互补配对结合，从而降解mRNA，沉默靶基因。这个机制在动、植物中广泛存在。另一种更加普遍的机制是通过与mRNA 3′UTR不完全互补，在翻译水平遏制基因的表达。这种机制下，miRNA只减少了靶基因在蛋白水平的表达，并未改变靶基因在mRNA水平的表达[12-13]。

随着研究的深入发现，miRNA具有高稳定性、时空特异性及细胞或组织特异性[14]。如成年人肝脏正常组织中高表达miR-122和miR-92a，而胎儿肝脏正常组织中则高表达miR-483；在一些肿瘤组织中低表达，而在正常组织细胞中高表达的有miR-143、miR-14、miR-199及let-7a等[15-18]。

3应用肝组织特异性miRNA降低腺病毒的肝脏毒性

2006年，Brown等[19]将miR-142-3p的靶序列插入到慢病毒载体中，遏制病毒在造血细胞系的复制，在非造血细胞系维持正常复制。这个实验展示了复制病毒载体设计的新形式。之后，人们把这种模式引入到腺病毒中，即在腺病毒复制早期必需基因E1A3′UTR或E1B3′UTR中加入几个拷贝组织特异性的miRNA靶序列。加入肝脏特异性miRNA靶序列可降低肝脏毒性，加入正常组织细胞与肿瘤组织细胞差异表达的miRNA靶序列可保护正常组织细胞，而使腺病毒在肿瘤细胞中的复制不受影响[15, 20-23]。

3.1选择肝脏特异性的miRNA靶序列 在肝脏中特异性表达的miRNA有miR-122、miR-1、miR-16、miR-27b、miR-30d、miR-126、miR-133、miR-143及let-7等，其中成年人肝脏中miR-122的表达量最高，达到肝脏所有miRNA含量的70%；每个肝细胞miR-122的拷贝数最高达66 000个，这也是所有细胞中表达量最高的miRNA[14,24]。根据Brown等[25]的研究结果，miRNAs的丰度必须达到100拷贝/pg总小RNA以上才能有效调控靶基因的表达，而MiR-122的丰度已远远超过这个界值。将肝特异性miR-122的靶序列插入到腺病毒早期基因E1A的3′UTR中，构建条件复制型腺病毒，此方法遏制了腺病毒在肝脏细胞中的复制[20-23]。

Cawood等[22]将4个拷贝的miR-122靶序列加入E1A基因表达盒的3′UTR区，结果发现，加入miR-122靶序列的小鼠肝脏中E1A的表达量减少(表达1/80)，病毒基因组拷贝数减少(表达1/50)，基本废除了肝脏毒性。

Suzuki等[21]在腺病毒荧光素酶基因表达盒的3′UTR分别加入4个拷贝的miR-122靶序列和miR-122的对照靶序列，构建了Ad-L-122aT和Ad-L-controlT。体外实验显示，Ad-L-122aT在高表达miR-122的人高分化肝癌细胞系Huh7和原代培养的鼠肝脏细胞中，荧光素酶的表达量约为对照病毒的1/3和1/70，而在低表达miR-122的人肝癌细胞系SKHEP-1和鼠胰岛内皮细胞系MS1中，荧光素酶的表达量并无明显变化[21]；体内实验显示，与对照病毒Ad-L-controlT相比，小鼠瘤内注射病毒，瘤内荧光素酶的表达量无明显变化，而小鼠肝脏中Ad-L-122aT的荧光素酶表达量则明显减少，减少到对照病毒Ad-L-controlT 的1/1500~1/50[21]。

3.2选择加入合适拷贝数的miRNA靶序列 在腺病毒早期基因3′UTR到polyA间插入miRNA靶序列的调控元件需要确定加入miRNA靶序列拷贝数。合适拷贝数的加入既可以兼顾腺病毒可加入外来基因的容量、减少实验的复杂性，又可有效吸附miRNA。

Cawood等[23]构建了由巨噬细胞病毒(cytomegalovirus, CMV)启动子控制的腺病毒荧光素酶基因报告载体pcmv-luc-mir，其分别插入0个、4个、8个拷贝的miR-122靶序列和4个拷贝的miR-122反义靶序列，评估这些载体在体外鼠肝细胞中的复制能力。结果表明，插入4个拷贝的miR-122靶序列的腺病毒有明显抑制效果，而插入8个miR-122靶序列并不比插入4个靶序列的遏制效果明显。插入4个反义miR-122靶序列的载体不改变荧光素酶的活性。研究还比较了野生型腺病毒Ad5WT与加入miR-122的Ad5-mir122在Balb/C小鼠基因组中的复制和肝脏毒性，结果发现，与野生型Ad5WT相比，Ad5-mir122能明显降低腺病毒基因组在小鼠肝脏内的复制，并降低肝脏毒性，同时还提高了动物对病毒的最大耐受量，Ad5-mir122最大耐受量可达到9×109～1.8×1010pfu/鼠。研究还另外证实，加入4个拷贝的miR-122靶序列明显比加入3个拷贝靶序列更有效[23]。

Cawood等[23]在5型野生型腺病毒E1A基因的3′UTR处加入4个拷贝的miR-122靶序列，构建了Ad5micr122，有效控制了腺病毒在鼠肝脏中复制。Zhang等[26]在Ad6早期基因E1A的3′UTR加入4个拷贝的miR-122的靶序列，选择性治疗去势前列腺癌，其有效降低了肝脏毒性，提高了治疗剂量，增强了全身的抗癌效果。

3.3miR-122调控基因表达模式降低肝脏毒性的严谨性

3.3.1加入miR-122靶序列得到的遏制作用是由miR-122特异性介导的Ylösmäki等[20]将一段异位序列(ACCAUGG)插入到Ad5/3E1A mRNA的5′UTR，产生新的腺病毒Ad5/3K与Ad5/3相比，E1A水平降低，但并未影响病毒复制。在Ad5/3K基础上又构建了新的腺病毒Ad5/3K-122，即在Ad5/3K复制早期必需基因 E1A的3′UTR加上3个拷贝的miR-122 靶序列，其感染肝脏细胞Huh7后，Ad5/3K-122组难以检测到E1A和其他腺病毒蛋白；而在Ad5/3K组，E1A和其他腺病毒蛋白的表达水平有增加的趋势[20]。在低表达miR-122 的肺癌细胞系A549中，两组E1A和其他腺病毒蛋白的表达量并无明显差异[20]。Huh7和A549细胞实验共同证明了Ad5/3K-122复制的大量减少是由miR-122介导的。同时该研究还转染了miR-122的抑制物到Huh7细胞中，遏制了miR-122靶序列的影响，证明靶序列的遏制能力的确是由miR-122介导的[20]。插入miR-122靶序列是一个非常有效的遏制腺病毒在肝脏中复制并降低肝脏毒性的策略，其并不影响腺病毒在其他类型细胞中的复制能力。

Cawood等[22]构建了一组分别插入不同拷贝的miR-122靶序列和插入4个拷贝miR-122的反义靶序列的pcmv-luc-mir 载体，结果发现，插入miR-122靶序列的载体荧光素酶活性明显降低，而插入4个反义miRNA靶序列的载体不能改变荧光素酶的活性。在此基础上，又构建了腺病毒载体AD-E1A-luc 和AD-E1A-luc-mir122(包含4个miR-122的靶序列)分别感染miR-122阴性细胞A549、OVCAR-3和阳性细胞Huh7，结果发现，AD-E1A-luc-mir122的复制只在阳性细胞Huh7中得到遏制[22]；注射上述病毒到Balb/C 小鼠肝脏中，AD-E1A-luc-mir122的复制也得到有效遏制[22]。另外，在A549中加入miR-122的类似物，结果AD-E1A-luc-mir122的复制同样得到了遏制，而AD-E1A-luc的复制不受影响[22]。以上研究证明上述遏制作用是由miR-122介导的。

Suzuki等[21]在荧光素酶基因表达盒的3′UTR加入4个拷贝的靶序列，构建出Ad-L-122aT，接着又构建了Ad-L-controlT，即把miR-122的靶序列换成对照序列。研究结果表明，腺病毒中的miR-122靶序列能明显抑制转基因的表达而不改变转基因在肿瘤内的转导。

3.3.2miRNA介导的调控不改变组织细胞中内源性miRNA和miRNA靶标mRNA的量Cawood等[23]在Ad5WT复制早期必需基因的3′UTR加入4个拷贝的miR-122靶序列，其构建的Ad5micr122能有效地遏制E1A在鼠肝脏细胞中的复制，同时研究证明这种方法并未改变miRNA的总量和miR-122内源靶标mRNA的稳定性。

3.3.3插入miR-122靶序列的腺病毒是否会通过突变逃逸对其的遏制作用插入miR-122靶序列的腺病毒是否会通过突变靶序列逃逸这种遏制将决定这种调控模式的成败。Ylösmäki等[20]观察了感染CRAds的Huh7细胞2周后未发现突变，猜想即使存在突变，这个过程可能也是一个缓慢的过程，在腺病毒被免疫系统清除前不会发生。那么miR-122靶序列对肝细胞中腺病毒复制的遏制是完全可以达到的。

4应用正常组织与肿瘤组织差异表达的miRNA降低腺病毒对正常组织细胞的毒性

Kawashima等[27]和Taki等[28]的实验表明，传统的端粒酶启动子特异的完全复制腺病毒(telomerase-specific replication-competent adenovirus，TRAD)感染原代纤维母细胞3 d后，腺病毒基因组会增加大约100倍，也就是说端粒酶启动子的特异性和严谨性是相对的，所以在应用特异性启动子的基础上，采取进一步措施阻止腺病毒在正常细胞中的复制显得尤为重要[15]。

在正常细胞中高表达而在肿瘤组织中低表达的miRNA有miR-143、-145、-199及let-7等[16-17]，其中对let-7的研究较多。let-7在很多癌细胞中的表达都是下调的，如直肠癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、恶性黑色素瘤、淋巴瘤及急性淋巴细胞白血病等。Edge等[29]在野生型口腔疱疹病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)复制早期必需蛋白基质蛋白(matrix protein,M)3′UTR分别插入3个拷贝的let-7a靶序列、与let-7a无碱基互补配对的序列以及与let-7a部分碱基互补配对的序列，构建VSVlet-7wt，VSVlet-7mut和VSVlet-7mm。口腔疱疹病毒对siRNA和miRNA介导的遏制非常敏感。研究证实，这种加入靶序列的方法大量遏制了VSV M 基因在正常人原代纤维原细胞系GM38中的表达，但在人肺癌细胞系A549中的复制不受影响，而且该方法不影响病毒基因组的基因[29]，提示miRNA的调控模式在降低病毒对正常细胞的毒性方面是有效的。

Jin等[30]在Ad5/11的E1A 3′UTR分别加入8个拷贝的let-7靶序列和let-7靶序列的突变序列，构建了条件复制型腺病毒SG7011let7T和SG7011let7MT，通过蛋白印迹法和逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测E1A蛋白的表达。相对于WAd5和SG7011let7MT，在正常肝脏细胞系L-02和正常胚胎肝脏细胞系WRL-68中，SG7011let7T的复制被大量遏制，其明显减轻了肝脏毒性，且不改变腺病毒在肝癌细胞系(HepG2、Hep3B、PLC/PRF/5、Huh7)中的溶瘤效果。

神经元特异性的miRNA7在正常脑组织中高表达，但在神经胶质瘤中的表达显著下调[31-32]。利用此特性，Leber等[33]在荨麻疹病毒(measles viruses, MV)中由CMV启动子控制的融合蛋白基因F 3′UTR中加入miRNA7的靶序列，构建出MV-EGFPmiR-7。小鼠体内实验证实，MV-EGFPmiR-7既保证了小鼠皮下异种移植神经胶质瘤内的溶瘤效率，维持了其抗肿瘤活性，也明显抑制了该病毒在正常神经组织中的复制，显著降低了小鼠感染荨麻疹病毒致死的风险[33]。

5应用肝特异性miRNA和差异表达的特异性miRNA提高腺病毒的安全性

用于构建传统条件复制型腺病毒的组织特异性启动子的严谨性是相对的。利用hTERT调控E1A基因构建的受端粒酶活性调控的复制型腺病毒(telomerase-specific replication-competent Ad，TRAD)以低剂量(2 MOI)感染人肺纤维原细胞Wl-38，腺病毒基因组的拷贝数很低；但剂量提高到10 MOI时，病毒感染3 d后，Wl-38中病毒基因组的拷贝数仍会有500倍的增加[15]。病毒注射时，局部正常细胞周围的病毒浓度很可能达10 MOI，虽然正常细胞感染量不是很大，但TRADs的E1A蛋白和E4蛋白经各种机制也会影响正常细胞的功能。为了降低TRAD对正常细胞的毒性，Sugio等[15]在腺病毒复制早期必需基因E1的3′UTR区分别插入4个拷贝的miR-143、-145、-199a或let-7a识别的靶序列，构建了一组受端粒酶活性和miRNA双调控的TRAD。用RT-PCR定量检测病毒基因组拷贝数发现，这些插入特定序列的TRADs与传统的TRADs相比，具有相同的溶瘤能力，但其在培养的正常细胞系和原代细胞中的复制能力明显降低，仅是传统TRADs复制量的1/1000左右[15]。

为了遏制腺病毒在肝脏细胞中的复制，降低其对肝脏的毒性，进一步构建了一个同时包含miR-122和miR-199识别靶序列的重组腺病毒TRAD-122a/199aT。TRAD-122a/199aT在正常细胞(W138、NHLF、PrSC、Nhep及SAEC)以及高表达miR-122的Huh7细胞中，E1基因的表达相对于传统TRAD E1基因的表达效率减少(表达1/50~1/10)；而在肺癌肿瘤细胞A549、人结肠癌细胞系 HT29、人非小细胞肺癌细胞系H1299以及肝癌细胞HepG2与传统TRAD中E1A基因的表达无显著区别[15]。TRAD-122a/199aT应用肝脏特异性miR-122 及肿瘤与正常组织差异表达的micro199同时调控E1基因表达的策略，进一步提高了腺病毒的安全性[15]。

6小结

随着越来越多组织特异性miRNA的发现，应用miRNA 调控腺病毒复制的策略将越来越成熟，联合应用各种方法，针对特定情况多层次控制腺病毒复制，以达到最大治疗效果和最低毒副作用将仍是这个领域的主要研究方向。

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Building Safer Adenovirus by Using of Tissue-specific MicroRNAWANGRong-hua,WANGHui-ping.(ExperimentalResearchCenter,theFirstPeople′sHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200080,China)

Abstract:Oncolytic adenovirus has been considered as one of the most potential agents for cancer treatment,though in the process of application,it is still associated with serious toxic and side effects,especially hepatotoxicity.For the purpose of better aiming at the target,oncolytic adenovirus with better safety and effect is needed to be prepared.In recent years,many scientists utilized microRNA-regulated gene expression system to build safer and effective adenoviruses.Several copies of complementary sequences for tissue or cell-specific microRNAs are incorporated into the 3′-untranslated region of the E1 gene expression cassette to control post-transcriptional adenovirus replication.This strategy can effectively eliminate the toxic and side effects and significantly improve the safety profiles.

Key words:Neoplasms; Adenoviridae; MicroRNAs

收稿日期：2014-03-20修回日期：2015-05-30编辑：辛欣

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.22.008

中图分类号：Q782；R373.9

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)22-4053-04