抗草甘膦玉米研究进展

齐 欣 ，李 明 ，王延波 ，马 骏 ，刘欣芳 ，姜 敏 ，杨佳颖

（1.辽宁省农业科学院玉米研究所，辽宁沈阳 110161；2.辽宁医学院医疗学院，辽宁锦州 121013）

草甘膦是世界上使用面积和销量最大的化学除草剂，抗草甘膦玉米是转基因农作物中推广和应用最成功的案例之一，其几乎覆盖所有允许种植转基因玉米国家的玉米种植地区，且种植面积年年增加。2012年，全球玉米种植面积为1.75亿hm2，转基因玉米品种种植面积占其中的35%[1]，其中多数为抗草甘膦转基因玉米或含有抗草甘膦基因的复合性状转基因玉米。2014年，我国玉米种植面积达到3 690万hm2，草甘膦使用和出口量已达到全世界草甘膦市场总量的20%。我国正逐步放开对转基因玉米种植的限制，而目前在全世界范围内种植的抗草甘膦作物均为国外专利品种，一些具有垄断地位的跨国公司正积极的申请抗除草剂转基因玉米在中国的商业推广。及时研发具有自主知识产权的抗除草剂基因及其玉米品种，才会使我国的玉米产业体系免遭毁灭性打击。

1 草甘膦研究与应用

草甘膦（Glyphosate）是磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的竞争类似物，通过植物地上绿色茎叶角质层吸收后，随光合作用产物从韧皮部快速传导至整个植株的各个部位，可防除单子叶和双子叶、一年生和多年生、草本和灌木等40多科的植物。因其本身广谱、内吸传导式、低毒、低残留、可混性强、价格合理、独特的靶标和作用机理等自身优点，自孟山都公司开发生产推向市场，草甘膦得到迅速的推广应用。2005年，全世界草甘膦销售量为35万t；2012全球草甘膦销售量为71.86万t，销售额为54.6亿美元，2014年全球用量已达80万t以上，预计2020年约需100万～120万t。2014年，我国草甘膦农药登记为806个，其中以原药登记的多达147个。2014年，我国草甘膦生产量占世界总量50%以上，达到39万t。

在植物体内其占据5-烯醇丙酮莽草酸-3磷酸酯合成酶（EPSPS）的第2个底物PEP的结合位点与莽草酸-3-磷酸（S3P）、EPSPS合成为 EPSP-S3P-草甘膦复合体，竞争性抑制莽草酸代谢途径中关键酶EPSPS（该酶广泛存在于植物的叶绿体中）活性[2]，导致S3P不能有效地转化为5-烯醇丙酮莽草酸-3磷酸（EPSP），造成：①大量的碳流向S3P，莽草酸大量积累，产生毒性；②植株能量损耗加剧（酶分子S3P的积累消耗1分子PEP和1分子ATP）；③抑制芳香族氨基酸化合物（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）的合成，导致蛋白质的合成及次生产物若干代谢反应失调，从而导致植株失绿死亡。其作用靶点有3个：质体EPSP合成酶、胞质EPSP合成酶以及胞质3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮-7-磷酸合成酶。

2 抗草甘膦玉米研究

EPSPS存在于高等植物和微生物体内[3-5]，是莽草酸途径的关键酶，同时也是草甘膦在细胞内的唯一靶标[6]。在植物细胞中，EPSPS基因存在于细胞核中，但成熟蛋白位于叶绿体内，而且EPSPS也只有在叶绿体中与其他莽草酸途径的成员共同作用才能合成芳香族氨基酸，信号肽位于EPSPS前体的N端，其对EPSPS前体正确定位到细胞叶绿体起到重要作用。植物EPSPS成熟酶的序列相似性很高，而叶绿体信号肽序列的相似性却较低，来源于植物的EPSPS与来源于细菌的EPSPS相似性高于真菌的EPSPS[7-11]。

2.1 细胞与组织培养方法

在细胞与组织培养基中逐步提高草甘膦的浓度，选择耐草甘膦突变体，通过提高自身EPSPS活性，从而产生高抗草甘膦作物品种。Smart等[12]发现在添加5mM草甘膦的植物培养基中常绿紫堇细胞EPSPS的活性提高40倍；Widholm等[13]通过长期不断提高细胞培养基中草甘膦浓度，使得苜眷、大豆、烟草3种植物细胞的EPSPS活性分别提高了62、21和800倍，并发现EPSPS基因的拷贝数和mRNA水平均升高了很多。祝水金等[14]采用体细胞培养获得抗草甘膦的棉花突变体，其草甘膦抗性为单基因显性遗传，杂交后代仍具有抗草甘膦的特性。赵锦慧[15]利用体细胞筛选法进行抗草甘膦突变体的筛选，筛选得到在细胞水平上能抗0.5 mL/L草甘膦、植株水平上抗0.9 mL/L草甘膦的突变体。但至今为止还没有关于玉米品种选育研究成功的报道。

自然界草甘膦抗性发展的速度依赖于有机体繁殖时间和基因复制的稳定性，而高等植物之所以在自然情况下产生对草甘膦的抗性几率很低，是由于其相对高的复制稳定性以及繁殖一代的时间较长。所以，Padgette等[16]认为实验室模拟草甘膦环境筛选抗性植株突变体的效率很低，要想取得成果是很困难。

2.2 转基因方法

2.2.1 基于对EPSPS基因的修饰。对EPSPS基因的修饰策略有2个，一种是植株体内EPSPS过量表达，进而增加对一定剂量草甘膦的耐受性。Rogers等[17]在细胞中转入携带具有抗草甘膦大肠杆菌中aroA基因的多拷贝质粒，细胞EPSPS表达量约为原来5～17倍，并表现出至少8倍的耐受草甘膦能力；Klee、Shah等[8，18]利用椰菜花叶病毒35S启动子分别在拟南芥和牵牛花中过量表达EPSPS，使转基因的植株、愈伤组织和细胞都提高了对草甘膦的耐受能力；通过EPSPS基因的过量表达，提供充足的酶活性满足生物合成代谢的需要，从而维持了植物正常的生理代谢活动；但多拷贝地转入外源基因有可能造成转入的基因沉默和抑制，也造成植物体内草甘膦的累积，使植物正常生长受到改变或抑制[19]，而且这种抗性不足以满足商业化使用的要求[18]，目前，通过EPSPS过量表达策略还未能获得可以在生产上应用的抗草甘膦作物。

另一策略是植株导入经过修饰后具有草甘膦抗性的EPSPS，使其合成与草甘膦亲和性下降的EPSPS，从而提高植株草甘膦耐受性。Comai等[20]首次从抗草甘膦的鼠伤寒沙门菌中克隆出一个由于氨基酸突变而获得抗性的aroA基因，并将这个突变的基因转到烟草中进行表达，获得了对草甘膦具有抗性的转基因烟草。Padgette[16]通过对多种来源EPSPS基因的研究，发现细菌和植物的EPSPS都拥有一段高度保守区域LXLGNAGTAXRXL（X为不保守的氨基酸），并且保守区域的氨基酸突变为丙氨酸和将脯氨酸突变为丝氨酸时，EPSPS虽与PEP的亲和性下降，但与草甘膦的亲和性下降的更多，从而提高对草甘膦的抗性。随后，一些学者利用各种手段从抗草甘膦植物和细菌中发现克隆出许多通过EPSPS上氨基酸位点突变，改造出许多具有增强草甘膦抗性的EPSPS[11，21-24]。

Lebrun等[25]对一种玉米的EPSPS基因定向诱变2个氨基酸，突变后的EPSPS对草甘膦产生了很高的抗性，第1代转基因抗草甘膦玉米GA21转入的就是该突变基因。但由于其所有权存在争议，没有得到充分推广。目前，来源于根癌农杆菌CP4菌株的EPSPS对PEP的亲和性较好，且高抗草甘膦[26]，是使用范围最广且转入作物中最多的抗性基因，据ISAAA网站资料显示，商业化利用ep4-epsps的抗草甘膦玉米品种有 MON801，MON802，MON809，MON810，NK603，MON832，MON87427，MON88017，其中NK603是获得最多国家批准生产的转基因作物品种。这是现在获得对草甘膦抗性的最主要方法之一。

2.2.2 转入能够消除草甘膦毒性的基因。与牺牲EPSPS和PEP结合催化活性为代价而获得对草甘膦抗性不同，转入能够消除草甘膦毒性的基因，在草甘膦发生作用前将其降解或解毒，使植物获得抗草甘膦功能。

目前，发现的降解草甘膦基因有从人苍白杆菌菌株LBAA中克隆出草甘膦氧化还原酶gox[27]，从一株高效降解草甘膦的类鼻疽假单胞菌中克隆到glpA和glp[26]，从地衣芽胞杆菌中克隆的编码草甘膦N-乙酰转移酶（NAT）的代谢基因 gat[28]、美国专利（20070107078）中报告的编码同源脱羧酶基因GDC-1和GDC-2细菌酶。据ISAAA网站资料显示，商业化推广的抗草甘膦玉米中利用gat4621的有78140， 利 用 goxv247 的 有 MON801，MON802，MON809，MON810，MON832。寻找和挖掘能够降解或解毒草甘膦的相关酶基因，进而培育出抗草甘膦作物，原理简单明确，是抗草甘膦转基因育种的另一条有效途径。

国内学者在抗草甘膦植物、细菌的分离筛选，抗草甘膦基因的克隆，细菌水平和作物水平基因验证，基因高效表达体系构建以及抗草甘膦玉米选育等方面进行了大量的研究，取得了长足的进步。截止2012年底我国注册批准的有关抗草甘膦专利有25项，国内单位及个人的占17项，其中15项是与抗草甘膦基因有关，2项与降解草甘膦的gat基因有关；正在审查中与抗草甘膦的有关专利为38项，国内申请22项；其他均为国外公司申请的专利。在已获国内专利的15个抗草甘膦基因有关抗性基因中2项来自水稻和苘麻，13项来自细菌，其中来自假单胞菌属的基因有8项。目前，只有林敏实验室的G2-epsps基因转让给国内奥瑞金公司进行商业开发。

2.3 生物和非生物逆境

在自然界中，同一物种不同株系间抗草甘膦能力存在遗传差异。通过生物和非生物逆境手段，筛选抗草甘膦突变单株或株系，再利用杂交、回交和分子辅助选择等手段选育抗草甘膦作物。陶波等[29]利用田间试验及生化分析的方法，对66份菜豆品种（系）进行抗草甘膦筛选，发现芳香族氨基酸含量高的品系具有较强的大田草甘膦抗性。吕晓波[30]利用化学诱变剂甲基磺酸乙酯（EMS）和叠氮化钠，对6个农艺性状优良的大豆品种进行种子处理。沈阳农业大学的魏松红等[31]应用紫外线和叠氮化钠对小麦种子进行诱变，获得抗草甘膦的小麦植株。

因植物基因稳定性及繁殖时间，这种方法前期需要长时间，大量的工作才能获得抗草甘膦突变单株或株系。但这种方法在转基因作物没有批准释放的国家，选育的抗草甘膦品种能规避国家转基因政策，且通过突变体可克隆出具有自主产权的抗草甘膦基因，避免国家转基因作物放开后，国外转基因产品对本国市场的冲击。

[1]JAMES C.Global status of commercialized biotech/GM crops[J].Ajcr Us，2005（34）：38.

[2]STALKER DM，HIATT WR，COMAI L.A single amino acid substitution in the enzyme5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase confers resistance to the herbicide glyphosate[J].The Journal of Biological Chemistry，1985（260）：4724-4728.

[3]AHMED SI，GILES NH.Organization of enzymes in the common aromatic synthetic pathway：evidence for aggregation in fungi[J].Journal of Bacteriology，1969（99）：231-237.

[4]BERLYN MB，GILES NH.Organization of enzymes in the polyaromatic synthetic pathway：separability in bacteria[J].Journal of Bacteriology，1969（99）：222-230.

[5]BERLYN M.，AHMED SI，GILES NH.Organization of polyaromatic biosynthetic enzymes in avariety of photosynthetic organisms[J].Journal of Bacteriology，1970（104）：768-774.

[6]STERINRUCKEN HC，AMRHEIN N.The herbicide glyphosate is a potent inhibitor of 5-enolpyruvyl-shikimic acid-3-phosphate synthase[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，1980（4）：1207-1212.

[7]GASSER CS，WINTER JA，HIRONAKA CM，et al.Structure，expression，and evolution of the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase genes of petunia and tomato[J].Journal of Biological Chemistry，1988（263）：4280-4287.

[8]KLEEHJ，MUSKOPF YM，GASSER CS.Cloning of an Arabidopsis thaliana gene encoding 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase：sequence analysis and manipulation to obtain glyphosatetolerant plants[J].Molecular Genetics and Genomics，1987（210）：437-442.

[9]SHYR Y，HEPBURN A，WIDHOHN J.Glyphosate selected amplification of the 5-enolpyruvylshik-imate-3-phosphate synthase gene in cultured carrot cells[J].Molecular and Genera Genetics，1991（232）：377-382.

[10]WANG YX，JONES JD，WELLER SC，et al.Expression and stability of amplified genes encoding 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase in glyphosate-tolerant tobacco cells.Plant Molecular Biology，1991（17）：1127-1138.

[11]ZHOU M，XU H，WEI XL，et al.Identification of a glyphosateresistant mutant of nee 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase using a directed evolution strategy[J].Plant Physiology，2005（140）：184-195.

[12]SMART CC，JOHANNING D，MULLER G，et al.Selective overproduction of 5-enol-pyruvylshikimic acid 3-phosphate synthase in a plant cell culture which tolerates high doses of the herbicideglyphosate[J].J.Biol.Chem.1985，260（30）：16338-16346.

[13]WIDHOLM JM，CHINNALA AR，RYU JH et al.Eggett T.and Brotherton J.E..Glyphosate selection of gene amplification in suspension cultures of 3 plant species[J].Physiologia Plantarum，2001（112）：540-545.

[14]祝水金，汪静儿，俞志华，等.棉花抗草甘膦突变体筛选及其在杂种优势利用中的应用[J].棉花学报，2003，15（4）：227-230.

[15]赵锦慧，赖颖，郭婕，等.不同草甘膦筛选方式对玉米抗性愈伤组织继代与分化的影响 [J].2011，39（4）：87-89.

[16]PADGETTE SR，RE DB，GASSER CS，et al.Site-directed mutagenesis of a conserved region of the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase active site.The Journal of BiologicalChemistry，1991（266）：22364-22369.

[17]ROGERS SG，BRAND LA，HOLDER SB，et al.Amplification of the aroA gene from Escherichia coliresults in tolerance to the herbicideglyphosate[J].Appl.Environ.Microbiol.1983，46（1）：36-43.

[18]SHAH DM，HORSCH RB，KLEE HJ，et al.Engineering herbicide tolerance in transgenic plants.Science，1986（233）：478-481.

[19]PLINE-SRNIC W.Technical performance of some commercial glyphosate-resistant crops.Pest Management Science，2005（61）：225-234.

[20]COMAI L，SEN LC，STALKER DM.An altered awA gene product confers resistance to the herbicide glyphosate.Science，1983（221）：370-371.

[21]HE M，NIE YF，XU P.AT42M substitution in bacterial 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase（EPSPS）generates enzymes with increased resistance to glyphosate.2003，6，67（6）：1405-9.

[22]GONZALEZ-TORRALVA R，GIL-HUMANES J，BARRO R，et al.Target site mutation and reduced translocation are present in a glyphosate-resistant Lolium multiflorum Lam.2012，9（58）：16-22.

[23]KAHRIZI D，SALMALMANIAN AH，AFSHARI A，et al.Simultaneous substitution of Gly96 to Ala and Alal83 to Thr in 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene of E.coli（kl2）and transformation of rapeseed （Brassica napus L.）in order to make tolerance to glyphosate[J].Plant Cell Reports，2007（26）：95-104.

[24]KAUNDUN SS，DALE RP，ZELAYA IA，et al.A nove P106L mutation in EPSPS and an unknown mechanism（s）act additively to confer resistance toglyphosate in a South African Lolium rigidum population.Journal of Agrictural and Food Chemistry，2011（59）：3227-3233.

[25]LEHRUN M，SAILLAND A，FREYSSINET G.et al.Mutated 5-enoylpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase，gene coding for said protein and transformed plants containing said gene[J].US Patent，2003（6）：566-587.

[26]PADGETTE SR，KOLACZ KH，et al.Development，identification，and characterization of a glyphosate-tolerant soybean line[J].Crop Science，1995（35）：1451-1461.

[27]BARRY G.，KISHORE G..Glyphosate tolerant plants[J].US Patent，1995（5）：463，175.

[28]CASTLE LA，SIEHL DL，GORTON R，et al.Discovery and directed evolution of a glyphosate tolerance gene[J].Science，2004（304）：1151-1154.

[29]陶波，秦智伟，曲桂芹，等.菜豆抗草甘膦基因筛选的研究[J].中国农学通报，l993（9）：31-33.

[30]吕晓波，王宏燕，刘琦.抗草甘膦转基因大豆（RRS）在黑土生态系统种植的安全性究[J].2009，28（2）：260-265.

[31]魏松红，纪明山，王英姿，等.应用诱变法筛选抗草甘膦小麦植株初步研究[J].现代农药，2006，5（3）：42-46.