白花鬼针草乙酸乙酯部位对R KO细胞线粒体膜电位的影响

吴建国，吴岩斌，万仲贤，邹秀红，吴锦忠

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.永春县林业局，福建 永春 362600）

白花鬼针草（Bidenspilosavar.radiata Schult.Bip.）为菊科植物白花鬼针草的全草，为泛热带性植物，是民间草药，具有利湿退黄、清热解毒、散瘀活血的功效，主要用于治疗痈肿疮疖、感冒发热、湿热黄疸、风湿痹痛等［1］。我们前期研究表明白花鬼针草乙酸乙酯部位（E E－B P）含有多个黄酮类化合物［2］，能显著诱导结肠癌R KO细胞的凋亡［3］。线粒体膜电位（△Ψm）的破坏是细胞凋亡早期发生的一个标志性事件，细胞受到凋亡诱导后线粒体膜电位的变化使得膜的通透性发生改变。膜通透性的增加，使得线粒体蛋白包括细胞色素C等，从线粒体基质释放到细胞浆。细胞色素C的释放伴随膜电位的完全丧失，进而引发细胞凋亡酶的级联效应［4］。我们应用流式细胞术，以J C－1（5，5＇，6，6＇－四氯－1，1＇，3，3＇－四乙基苯并咪唑羰花青碘化物）为荧光探针检测E E－B P对结肠癌R KO细胞线粒体膜电位的影响。

1 材 料

1.1 药物和细胞株 白花鬼针草购自福建省泉州市永春县药材市场，经福建中医药大学药学院杨成梓副教授鉴定为菊科植物鬼针草属白花鬼针草Bidenspilosavar.radiata Schult.Bip.的全草，人结肠癌R KO细胞购自中国科学院上海生命学院细胞资源中心。

1.2 试剂 石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和乙醇为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；DMEM培养液、胰蛋白酶、胎牛血清（美国Hyclone公司）；青霉素－链霉素双抗试剂（北京鼎国昌盛生物技术有限公司）；细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）。

1.3 仪器YXQ－LS－70A立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；SW－CJ－1FDA超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；BCD－518WSA冰箱（中国海尔集团有限公司）；Eppendorf移液器、5417R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；AnkeTDL－50B离心机（上海安亭科学仪器厂）；HF212UVCO2培养箱（香港HealForce公司）；D K－420型电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）；流式细胞仪（美国B D公司）。

2 方 法

2.1 乙酸乙酯部位制备 将干燥的白花鬼针草全草10k g置于多功能提取浓缩机组提取罐中，加75%的乙醇，浸泡12h，加压回流提取2次；合并提取液，过滤并减压浓缩，得到白花鬼针草的乙醇总提取物。总提取物以水混悬后，用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，乙酸乙酯萃取液经过减压浓缩、干燥后，得乙酸乙酯部位（EE－BP）。

2.2 含药培养液的制备取EE－BP以DMSO溶解后，配置成0、25、50、100μg／m L的含药培养液（含10%FBS、1%双抗的DMEM 溶液），以0.22μm微孔滤膜过滤除菌后密封，保存于4℃，备用。

2.3 R KO细胞线粒体膜电位检测 R KO细胞置于含10%F B S的低糖DMEM培养液的6孔板中，37℃、5%C O2饱和湿度的细胞培养箱中贴壁培养24h后，弃培养液；0、25、50、100μg／m L的含药培养液，干预12h后，胰蛋白酶消化后重悬；离心收集5×105细胞，PBS洗涤2遍；加入500μL的JC－1工作液吹打，将细胞混悬，并在培养箱中继续孵育20min，离心，弃上清；加入500μL的Incubation Buffer溶液重新混悬细胞，于流式细胞仪进行检测分析。

3 结 果

实验结果见表1、图1～图4。

表1 E E－B P对R KO细胞线粒体膜电位的影响（±s）

表1 E E－B P对R KO细胞线粒体膜电位的影响（±s）

注：与空白对照组比较，1）P＜0.01。

2550100线粒体膜电位 34.27±0.7410.26±1.551） 22.96±2.871） 29.92±3.451）组 别 n 空白对照组 E E－B P组／（μg／m L）

4 讨 论

在空白对照组中，△Ψm较高，部分以聚合体的形式存在，红色荧光强。随着E E－B P给药浓度的不断增加，红色荧光不断减弱，△Ψm去极化，J C－1部分以单体的形式存在，发出绿色荧光，其丢失率随着给药的浓度增加而增加，具有显著性差异，P＜0.01，说明E E－B P可以通过降低△Ψm，诱导R KO结肠癌细胞的凋亡。

［1］中华本草编委会 .中华本草［M］.上海：上海科学技术出版社，1999：735.

［2］WU J G，WAN Z X，WU Y B，et al.CHEMICAL CONSTITUENTS OF Bidens pilosavar.radiate［J］.Chem Nat Comp，2013，49（4）：759－760.

［3］WU J G，WAN Z X，Y I J，et al.Investigation of the extracts from Bidens pilosa Linn.var.radiata Sch.Bip.for antiox idantactivities and cytotoxicity against human tumor cells［J］.JNa t Med，2013，67（1）：17－26.

［4］姚成才，涂远荣，姜杰，等 .榄香烯乳诱导线粒体凋亡途径逆转肺癌A 549／DDP细胞株耐药［J］.现代肿瘤医学.2014，22（6）：1276－1281.