氨氧化微生物在氮循环中的生态功能及其影响因子

朱国洁+张娜+杜雯+李晓鹤+王晨+王欣丽

摘    要：氨氧化作用是硝化作用的第一步，也是限速步骤，其主要驱动者是氨氧化细菌和古菌，在全球氮循环中发挥着极其的重要作用。本文主要介绍了氨氧化细菌和古菌的种类和系统发育，综述了氨氧化细菌和古菌对硝化作用的相对贡献和环境影响因子，最后提出了研究展望。

关键词：氨氧化细菌;氨氧化古菌;碱性土壤;酸性土壤;环境因子

中图分类号：Q938.1+1           文献标识码：A          DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.12.011

Ecological Function of Ammonia Oxidizing Microorganisms in the Nitrogen Cycle and Their Influence Factors

ZHU Guo-jie1 ， ZHANG Na2， DU Wen1， LI Xiao-he1， WANG Chen1， WANG Xin-li1

（1. College of Resources and Environment of Linyi University， Linyi，Shandong 276005， China; 2. Financial Department of Linyi University， Linyi，Shandong 276005， China）

Abstract： Ammonia oxidation is the first step in nitrification and the rate limiting step. The main driver are ammonia oxidizing bacteria and archaea， which play an important role in the global nitrogen cycle. This paper mainly introduced the types and the development of the ammonia oxidizing bacteria and archaea. The relative contributions of the ammonia oxidizing bacteria and archaea to nitrification and environmental impact factors were summarized. Finally， the research prospect was put forward.

Key words： ammonia oxidizing bacteria; ammonia oxidizing archaea; alkaline soil; acid soil; environmental factors

硝化作用在土壤氮转化过程中是一个非常重要的步骤，它关系到外源铵态氮和矿化释放的氮在土壤氮循环中的转化以及土壤氮的损失。所涉及的过程关联着土壤的酸化、水体的富营养化以及温室气体N2O的排放等环境问题[1]。因此，硝化作用一直是氮转化过程中一个备受关注的环节。氨氧化作用是硝化作用的第一步反应，也是限速步骤[2]，其主要驱动者是氨氧化细菌（Ammonia-oxidizing bacteria，AOB）和氨氧化古菌（Ammonia-oxidizing archaea，AOA），因此对它们的研究引起了广泛的关注。

1 系统发育地位

1.1 氨氧化细菌

氨氧化细菌普遍存在于土壤、地表水和沉积物中，还被发现在建筑沙石、苏打以及南极冰层等一些极端的生态环境中也有存在。Woese等[3]基于16S rRNA结果比对发现，两类在系统发育上明显不同的类别组成了氨氧化细菌：一类是属于变形菌门（Proteobacteria），包含海洋硝化球菌（Nitrosococcus oceanus）的γ-亚纲;另一类也是属于变形菌门，包含活动硝化球菌（Nitrosococcus mobilis） 的β亚纲。变形菌门的β亚纲又包含3个分支：其一是Nitrosococcus mobilis;其二是欧洲亚硝化单胞菌（Nitrosomonas europaea）;其三是亚硝化螺旋菌（Nitrosospira） 、亚硝化叶菌（Nitrosovibrio） 和亚硝化弧菌（Nitrosolobus）。Head等[4]在基于16S rRNA的核苷酸序列对AOB的系统发育树开展同源性比较时，将亚硝化弧菌、亚硝化螺旋菌亚和硝化叶菌都归类到亚硝化螺旋菌属。分子系统发生学分析表明，陆地生态系统中的优势种群Nitrosospira和Nitrosomonas可以分成9个不同的系统发生簇（cluster）。

1.2 氨氧化古菌

在系统发育与进化方面，AOA形成了一类完全独立于AOB的进化分支。基于16SrRNA基因系统发育分析表明，聚类在泉古菌的不同AOA分支其生态来源也不同：聚类于Group 1.1a的AOA来源于海洋、大部分水体和沉积物;聚类于Group 1.1b的AOA来源于土壤及其它陆地环境。基于amoA基因，在系统发育树上嗜高温AOA独立于海洋和土壤分支。基于16S rRNA基因和AOA的amoA基因的系统发育分析结果显示，二者能很好地重合。除此之外， Group 1.1c类群也被发现，并认为它们可能也参与了氨氧化过程，但目前还没有找到相应的amoA序列[5]。

2 氨氧化微生物对土壤氮循环的相对贡献

研究表明，虽然地球环境中存在大量的氨氧化古菌和氨氧化古菌的amoA基因，但并不说明该基因一定会在驱动氨氧化过程中发挥作用[6]。

2.1 氨氧化细菌在碱性土壤中的主导作用

在中性和碱性土壤中，施肥尤其是高量氮肥的施入，显著改变了AOB的群落组成，并且数量也有增加，但对AOA却没有显著影响。暗示AOB在这些土壤中更加“活跃”。Shen等[7] 对河南封丘长期定位试验站中碱性潮土（pH=8.3～8.7）的研究中发现，不同施肥处理下AOB的数量均显著低于AOA，但不同施肥处理仅导致AOB群落结构发生了变化，对AOA的群落组成并没有产生明显的影响，而且只有AOB的丰度与与土壤硝化潜势呈显著正相关。推测在这些碱性潮土中主要是AOB对土壤硝化作用产生贡献。同样地，在对新西兰高氮草地土壤的研究中，Di等[8]也发现施氮肥增加了AOB的丰度和土壤的硝化强度，这种增加可被硝化抑制剂DCD明显抑制，对AOA却没有明显的影响。

利用DNA-SIP技术，Xia等[9]研究发现在河南封丘碱性潮土中，只有AOB参与了氨氧化过程和13CO2的固定，AOB在该土壤硝化作用中发挥了主导作用。Jia and Conrad[10]在对德国中性农田土壤进行研究时仅发现AOB能够同化CO2，推测AOA可能并没有参与土壤的硝化过程，或者因AOA只是利用了极少量的13CO2而没能分离到足够量的标记DNA，认为AOB是该土壤硝化作用的主要贡献者。同样，Jiang等[11]发现在碱性水稻土壤（pH=8.0）中硝化作用的主导者也是AOB（Nitrosospira Cluster 3）。Wang等[12]在对江西玉米地长期定位施肥土壤进行DNA-SIP研究时发现，不施肥对照、施N肥和NPK肥的土壤pH值为酸性，AOA在同化CO2的过程中占据了主导地位;而长期施有机肥的土壤pH值接近中性，主要是AOB参与了CO2的同化。

2.2 氨氧化古菌在酸性土壤中的主导作用

He等[13]通过对湖南祁阳旱地肥力及肥料效应长期定位试验点红壤的研究中发现，土壤pH值（pH= 3.7～5.8）因长期施用氮肥而显著降低，在8个不同施肥处理中，AOB的数量均显著低于AOA。不同施肥处理对土壤总细菌数量的影响并不明显，但显著影响了AOA和AOB的数量;而且AOB的群落组成在各处理之间没有显著差异，AOA的群落组成差异却非常明显[14]。这表明AOA的丰度和群落组成对长期施肥导致的土壤理化性质的变化所产生的响应比AOB更明显。而且，AOB和AOA的丰度与土壤硝化潜势呈显著正相关，推测酸性土壤中AOB和AOA对土壤硝化作用可能都有贡献。另有对我国南方酸性土壤中AOB和AOA群落组成调查的研究结果[15-16]也支持了这一推测。这些土壤中仅AOA的数量与土壤硝化潜势呈正相关，与AOB的数量并没有关系;而且茶园土壤中AOA与AOB的数量之比随pH值的降低而增加。这些结果表明：在酸性土壤氨氧化作用中，AOA可能比AOB更加活跃。

应用基于DNA分析的稳定性同位素探针技术（DNA-SIP） ，Zhang等[17]根据氨氧化微生物氧化氨的同时固定CO2进行自养生长这一原理，加入13C标记的CO2作为底物对土壤（pH=3.7）进行培养，发现“活跃的”氨氧化微生物是AOA中的Group 1.1a-associated类群，在氨氧化过程中发挥了主导作用，同化了13CO2进行了生长，并且氨氧化速率与AOA的amoA基因丰度呈显著正相关，但在AOB中没有发现这种现象。另外，Lu等[18]的研究结果同样表明Group 1.1a-associated类群是氨氧化作用的主要执行者。Wang等[19]在研究另一种酸性农田土壤时发现氨氧化作用的执行者是Group 1.1b类群。以上结果表明，氨氧化古菌主导了这些酸性土壤中的硝化作用。

AOA在酸性环境中发挥主要功能的可能机理包括[20]：（1） AOA对NH3的亲和力更高[21]，因此，在低浓度NH3的环境中更容易生长。酸性土壤的pH值较低，其中的氨多以NH4+的形态存在，NH3浓度较低，更适于对NH3亲和力较高的AOA生长。（2）很多研究表明，与无机氮相比，AOA的生长更易受有机氮的刺激，自养生长所利用的主要是有机质矿化所释放的低浓度NH3。另外，AOA也可能是混合营养型生长，直接利用土壤中的有机碳源[22]。因此，AOA比AOB具有更大的竞争优势。（3）AOA与AOB相比其生理生化和遗传特征更加独特，通过对几株纯培养的AOA基因组学的分析发现，AOA和AOB的氨氧化途径可能显著不同，而且AOA的氨氧化和碳固定过程能量的消耗明显减少，有助于它们在一些不利的环境中发挥作用[23]。

酸性土壤中AOA占主导与碱性和中性土壤中AOB占主导的研究结果，支持了这样一种猜测：两类氨氧化微生物的生态位具有明显的分化特征[24] 。即在中性和碱性土壤中，AOB发挥了功能活性;在低氮、强酸性和高温等较苛刻的环境中AOA是硝化作用的主要驱动者。近来从英国苏格兰酸性土壤中成功富积培养到的一株嗜酸氨氧化古菌Nitrosotalea devanaterra，其适宜的生长pH值为4.0～5.0，当pH>5.5时生长受抑制[25]，更进一步证实了以上观点。

3 环境因子对氨氧化微生物的影响

土壤拥有非常复杂的环境体系，其理化性状决定着土壤中微生物群落的数量和分布。土壤氨氧化微生物的分布除了与土壤养分状况紧密相关[26]，还与土壤pH值[27]、NH3浓度[28]、土壤管理方式[29]和植被[30]等有很大的关系。

3.1 pH值

硝化作用底物的生物可利用性和化学形态均受土壤pH值影响，同时pH值也影响AOB和AOA的生长和功能活性，进而影响它们对硝化作用的相对贡献[31]。随着农田土壤硝化作用的不断加强，显著降低了土壤的pH值，AOA的amoA丰度明显下降，表明pH值可能是影响土壤AOA数量的重要环境因子[32]。另有研究表明，在pH=8.3～8.7的碱性土壤[33]和pH=3.7～6.0[34]的酸性土壤中AOA的amoA基因丰度与pH值也呈现较好的负相关。但是也有研究表明，AOA的amoA基因丰度随着土壤pH值的升高而增加[35]，或者没有显著变化[36]。

Gubry-Rangin等[37]认为 pH值是唯一测量到的显著影响AOA群落和结构的土壤理化性质。在酸性土壤中，相对丰度较高的AOB是Nitrosospira cluster 2[38];而Carnol等[39]证明，在高氮负荷的酸性褐色土壤中AOB的群落是以Nitrosomonas europaea为主。

一般认为，在pH值<6.5的环境中AOB不易生长，其适宜生长的pH值范围为7.0～8.5。Yuan等[40]和Zhang等[41]的研究发现，在红壤pH值比较低的条件下对氨氧化微生物的群落结构具有选择性。另外，研究发现酸性和碱性土壤中氨氧化微生物的活性存在着明显差异。He等认为在酸性红壤中，氨氧化势与AOA的丰度呈正相关，而与AOB的丰度无关;相反地，Shen等[7]在研究中性和碱性土壤时发现，氨氧化势与AOB的丰度呈正相关。Hu等[42]通过高通量测序，认为pH值最能解释AOA和AOB的生态位分异;Wang等[12]利用DNA-SIP技术，发现长期定位施肥改变了土壤的pH值，“活跃的”氨氧化微生物群体也发生了变化。

3.2 土壤中NH3的浓度

氨的氧化为缓慢生长的硝化微生物提供唯一的能量，因此氨介质的可利用性被认为是AOA和AOB不同生态分异的主要影响因素[43]。以前的研究表明，一些含氨量很低的生态系统中，也有未知的氨氧化微生物出现，因为原位条件下氨介质的浓度显著低于AOB的生长需要[44]。同样，在调查不施肥、施矿质肥和矿质肥加有机肥时，发现amoA基因拷贝数的AOA与AOB之比在不施肥土壤中最高[45]。研究表明，在大量施肥的土壤或者湿地中AOB丰度和硝化强度显著正相关;而且AOA的生长受到高水平氨的抑制[46]。

在当前研究中从陆地或者海洋生态系统中培养或者富集古菌的抑制浓度是0.89～356 μmol·L-1，远低于AOB的可培养浓度394～40 000 μmol·L-1。这表明AOA具有更低更窄的介质生长范围。被富集的AOA的Km值仅为0.61～0.69[47]。相比较来说可培养AOB的Km常数是50～1 780 μmol·L-1，因此AOA具有更高的NH3亲和力，大于可培养AOB的200多倍[48]。说明AOA在pH值较低的低氨环境中相比AOB有更大的竞争能力。

3.3 温 度

合适的温度对于生物酶催化新陈代谢非常关键，从而影响AOA和AOB的组成和活性等。Urakawa等[49]研究发现，较低的温度会使AOB的数量和多样性降低。Avrahami等人[50]发现，在中温（10～25 ℃）时AOB的硝化潜势最高，低温（4 ℃）或高温（37 ℃）时会显著降低。在年平均气温差异非常明显的土壤中，酸性土壤（pH=5.0～5.8）中AOB的物种组成有差异，优势物种也不相同;弱碱性土壤中只有Nitrosospira cluster 3a随温度发生变化，且Cluster 3a只在高温低肥的土壤中存在。在水簇箱过滤系统中，温度较低时，AOA多样性也低[49]。Tourna等[51]进行微生态系统培养试验时，设计了不同的温度（10～30 ℃，5 ℃为一梯度）梯度，对其进行DGGE群落结构分析后发现，AOA群落结构在不同培养温度下差别较大。

3.4 通气与水分条件

大部分的氨氧化微生物属于好氧自养型微生物，需要在O2的参与下完成氧化NH4+产生ATP的过程。氧分压与含水量呈负相关性，过低和过高的含水量对土壤硝化作用均有不利的影响。含水量高时土壤中氧气含量低，对硝化微生物的代谢不利;含水量低时土壤中的氧气可以完全充满土壤，但干燥的土壤环境对硝化微生物的存活不利[52]。一般情况下认为，田间最大持水量（WHC）的 50%～70%为最适合硝化作用的土壤含水量[53]。在研究稻田土壤的硝化作用时发现：土壤的氧负压决定着淹水土壤中硝化作用是否存在，硝化微生物能否繁殖和存活;在一定范围内，硝化作用在低氧化还原电位条件下仍然可以进行;当硝化细菌的活性不被NH4+浓度所限制时，土壤硝化作用强度随着淹水层O2浓度的增加而显著增强[54]。稻田根际土壤与非根际土壤相比常常具有较高的氧化还原电势， AOB的amoA基因数量在非根际土壤和根际土壤中变化不明显，但是非根际土壤AOA amoA基因的拷贝数显著低于根际土壤，AOA与AOB的amoA 基因比值在1. 2～69. 3的范围内波动[55]。

4 结论与展望

氮循环过程中AOB和AOA的贡献问题一直是该领域研究的重点，与生态因子的改变密切相关。利用同位素示踪技术能准确定位AOB和AOA的生态功能，明确AOB和AOA在氨氧化作用中的相对贡献，具有重要的生态环境和生物进化意义。今后应尽可能地分离、筛选不同生态环境条件下的氨氧化微生物，研究它们生理生态功能和生化特征，进一步深化对硝化作用机制的认识。另外，还应从大尺度上研究土壤氨氧化微生物群落分布和功能的特点，进一步明确其时空演变特征和驱动氨氧化微生物生态位分异的主要环境因子。除此之外，今后研究的重点还有评估氨氧化微生物在硝化过程中的作用，包括对温室气体N2O释放的贡献和其他可能的生态功能等。

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