俄罗斯库页岛潮间带沉积物可培养细菌的系统发育多样性

刘 杰, 卜蒙蒙, 孙 景, 王延鹏, 李慧鹏, 张德超

(1. 青岛科技大学 生物工程与技术系, 山东 青岛 266042； 2. 中国科学院 海洋研究所 海洋生物分类与系统演化实验室, 山东 青岛 266071)

库页岛属俄罗斯最大的岛屿, 面积 7.64万 km2,大陆性气候, 冬季气候寒冷, 夏季凉爽多雾。该岛地处北太平洋, 位于我国黑龙江出海口的东部, 东、北面临鄂霍次克海, 西隔鞑靼海峡及涅韦尔斯科伊海峡并与俄罗斯哈巴罗夫斯克边疆区相望, 南隔宗谷海峡与日本北海道宗谷岬相对。库页岛上现有6 000多条河流和1 600余个湖泊, 其自然生态环境受人类活动干扰较少,同时来自鄂霍次克海西岸的沉积物源, 其形成速率、厚度和有机碳含量等均为各类微生物生长提供了良好而独特的生存环境。一般来说, 特殊生态环境是获取微生物新种质资源的有效途径, 也是进行微生物新型生物活性物质研发的基础。而库页岛区域(包括潮间带)这类特殊生境的微生物多样性状况如何, 至今尚未见报道过。

本研究于2013年9月份从库页岛潮间带的4个采样点采集了沉积物样本若干份, 然后利用2216E、R2A、M1三种常规、寡营养海洋细菌培养基, 对其可培养细菌进行分离、纯化和基于 16S rRNA 基因序列测定的系统发育分析, 目的在于了解库页岛特殊生态区潮间带沉积物可培养细菌的多样性状况,寻找和发现新的物种或分类单元。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集

4份沉积物样品分别于 2013年 9月 6日—11日采集于俄罗斯库页岛潮间带, 地理坐标分别是：R-1 (47°08'30.1”N/142°03'30.1”E), R-2(46°56'39.3”N/143°05'46.7”E), R-3 (46°25'3.3”N/141°51'0.7”E) 和R-4(48°00'48.6”N/142°82'14.3”E)。去掉样品表层约5 cm, 采集5～20 cm处沉积物样品, 用灭菌的50 mL离心管 4℃暂时保存, 带回实验室后立即进行菌株分离。所有采样工具均事先经过无菌消毒。

1.1.2 分离培养基

2216E培养基(H)： 蛋白胨5 g, 酵母提取物1 g,琼脂15 g。用1 000 mL 海水配制, pH 7.5。

R2A培养基(R)： 蛋白胨0.5 g, 酵母提取物0.5 g,葡萄糖0.5 g, 淀粉0.5 g, K2HPO40.3 g, MgSO40.05 g,丙酮酸钠0.3 g , 琼脂15 g。用1 000 mL 海水配制,pH 7.0。

M1培养基(M)： 蛋白胨2 g, 酵母提取物1 g, 可溶性淀粉10 g , 琼脂15 g。用1 000 mL海水配制, pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 海洋细菌的分离

分别称取沉积物样品2 g, 加入到无菌的0.1%焦磷酸钠溶液中, 在25 ℃、150 r/min条件下振荡20 min。用生理盐水(0.9%, NaCl)对样品进行10倍系列稀释,涂布在三种不同的固体培养基上, 25℃培养 7 d, 根据菌落形态、颜色等特征挑取不同单菌落, 每个菌落纯化至少 2次。镜检合格后进行革兰氏染色和菌体形态观察拍照, 用 25%甘油将纯化菌株保存于-80℃超低温冰箱。所有步骤均按无菌操作进行。

1.2.2 海洋细菌的系统发育分析

分离纯化菌株用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀法[1]进行细菌总DNA的提取。PCR采用细菌16S rRNA基因扩增通用引物, 27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′), 1541r(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)。PCR 反应条件(30 个循环)： 94 ℃预变性, 4 min； 94 ℃变性 1 min； 55 ℃复性 1 min； 72 ℃延伸 1 min, 共 30个循环； 最后 72 ℃延伸 10 min。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳, 获得约 1.5 Kb的单一条带,再经切胶和试剂盒(天根生化科技有限公司产品)纯化后, 送深圳华大基因科技有限公司进行双向全长序列测定。序列通过在 NCBI网站 GenBank进行Blastn比对, 找到相似性最高且是有效发表的典型菌株序列, 用 Clustal X 和 Mega 5.0软件(采用Neighbor-joining方法)构建系统发育树。

本研究首先采用 27f单向引物对分离菌株进行16S rRNA基因的PCR扩增和测序, 然后根据测序结果比对后进行排重, 剩余菌株再进行 27f、1541r双向引物的全长序列测定。

2 结果与分析

2.1 分离菌株的测序结果与比对

本研究从采集样品中共分离得到82株可培养细菌菌株。经菌前期菌落、菌体形态观察、革兰氏染色、以及27f单引物初步测序后进行排重, 最终合并选取其中45株代表性菌进行双向全长16S rRNA基因(1.4～1.5 kb)测序。测序结果经在NCBI的GenBank中比对后, 发现它们主要分布在4个门、6个纲、27个属、44个种之中(表1)。其中变形杆菌门(Proteobacteria)为优势菌群(19株), 占所选45株代表菌比对种类的42.2%； 放 线 菌 门 (Actinobacteria)、 厚 壁 菌 门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)分别占总体的20.0%、20.0% 和 17.8%。从45株代表性菌的分离培养基来看, 有28株是2216E培养基分离得到的, 剩余17株菌是R2A、M1寡营养培养基分离得到的。

2.2 菌株的系统发育分析

将 45株代表菌的 16S rRNA基因序列提交GenBank进行注册(序列号为： KJ456596, KJ456597,KM362864-KM362906), 同时参考 Genbank和韩国EzTaxon 网站的比对结果及相关典型菌株序列, 利用软件 Clustal X 和 Mega 5.0并采用 Neighborjoining方法, 分别构建了变形杆菌门和拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门细菌的系统发育树。分别见图1、图2。从图1和表1可以看出, 本研究分离的优势菌为变形杆菌门(19株, 占45株代表菌比对种类的42.2%), 分布于α- Proteobacteria和γ- Proteobacteria两个纲。分布于α- Proteobacteria的菌株主要包括红细菌目(Rhodobacterales)和鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)。

其中属于红细菌目的有： 副球菌属(Paracoccus)、简纳西氏菌属(Jannaschia)、热带单胞属(Tropicimonas)、十八杆菌属(Octadecabacter)、浅玫瑰色洛克氏菌属(Loktanella)、居黄海属(Seohaeicola)和亚硫酸盐杆菌属(Sulfitobacter)。从16S rDNA 序列相似性来看, 菌株R-1-M-3同分离自日本海Chazhma Bay沉积物的浅玫瑰色洛克氏菌(L.rosea)[2]的相似性为 99.7%；菌株 R-3-M-5-3同来自韩国东海海水的海亚硫酸盐杆菌(Sulfitobacter marinus)[3]的相似性为 99.8%； 菌株R-3-H-5同来自日本海Troitza Bay海草的可疑亚硫酸盐杆菌(S.dubius)[4]的相似性为99.6%； 而菌株R-1-H-3、R-4-M-3、R-1-R-9和R-2-R-1同它们系统发育关系最近的模式菌株相似性均在97.3 %～98.1%之间, 以相似性大于98.5%作为同一个物种来估算[5-6](前提是 DNA-DNA杂交同源性≥70%, 且有独特生理生化等表型性状), 这 4株细菌有可能分别代表着副球菌属、热带单胞属、十八杆菌属和居黄海属内的潜在新种。在鞘脂单胞菌目中只有 R-1-M-12、R-1-R-17和 R-1-M-4-1 这 3株菌, 均属于色杆菌属(Erythrobacter)。其中菌株R-1-M-12与分离自日本神奈川的Aburatsubo内湾海藻的长红色杆菌(Erythrobacter longus)[7]的16S rRNA基因序列相似性为99.7 %； 菌株 R-1-M-4-1 与潮汐红色杆菌的模式菌株E. gaetbuliSW-161T系统发育关系最近[8], 16S rRNA基因序列相似性仅为97.7%, 依据上述定种原则, 该菌株也可能是色杆菌属内的一个潜在新种。

分布于 γ-Proteobacteria的菌株主要包括交替单胞菌目(Alteromonadales)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)和假单胞菌目(Pseudomonadales)。其中菌株R-4-R-4与分离自俄罗斯西伯利亚冻土的盐晶嗜冷杆菌Psychrobacter cryohalolentis的16S rRNA基因序列近乎相同(99.9%)[9]； 菌株R-3-M-11同分离自韩国南海海水的快生嗜冷杆菌Psychrobacter celer[10]的16S rRNA基因序列相似性为 99.2%； 菌株 R-2-H-2-1同分离自韩国济州岛黑沙滩的玄武岩希瓦氏菌Shewanella basaltis的16S rRNA基因序列相似性为99.1%； 而菌株 R-2-M-13 同解脂海杆状菌(Marinobacter lipolyticus)模式菌株的16S rRNA基因序列相似性为 97.9%[11], 亦可初步判定可能为海杆状菌属内的一个潜在新种。

表1 俄罗斯库页岛潮间带沉积物可培养细菌的分布Tab.1 Distribution of culturable bacteria isolated from intertidal sediments samples of Russian Sakhalin Island

图1 变形细菌门细菌的系统发育树Fig. 1 Phylogenetic relationships of culturable bacterial strains related to the Proteobacteria.

从图 2和表 1看出, 有 9株菌分布于放线菌门(Actinobacteria)的放线菌纲(Actinobacteria C)。其中菌株 R-1-R-13-1与分离自韩国济州岛海水的海水微杆菌Microbacterium aquimaris的系统发育关系最近, 16S rRNA 基因序列近乎相同(99.9%)； 菌株R-3-M-4-1与分离自韩国东海阿穆尔斯克湾海水的阿穆尔斯克湾盐地杆菌Salinibacterium amurskyense的 16S rRNA基因序列也近乎相同(99.9%), 推测菌株 R-1-R-13-1和 R-3-M-4-1分别与M.aquimaris和S.amurskyense为同一物种或菌株。而菌株 R-4-M-5和 R-4-H-33与相似性最高的、分离自日本 Shinjiko湖泊近岸沉积物的湖泊微杆菌(M.lacus)和法国利摩日高铀土壤的利摩日微杆菌(M. lemovicicum)[12]的 16S rRNA基因序列相似性分别为98.3%和98.1%, 推测有可能是微杆菌属内的2个潜在新种。剩余5株菌中, 除R-4-H-3与Demequina flavaHR08-7T的相似性为98.8%外, 其他菌株与最近标准菌株的相似性均大于98.3%。

图2 拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门细菌的系统发育树Fig. 2 Phylogenetic relationships of culturable bacterial strains related to Actinobacteria, Firmicutes and Bacteroidetes.

厚壁菌门(Firmicutes)细菌在近海和浅海沉积物中较为常见[13]。本研究表明, 分布于厚壁菌门的 9株菌均属于杆菌纲(Bacilli)。其中菌株 R-1-R-2A与分离自韩国黄海的 Daepo海滩滩涂的海微小杆菌Exiguobacterium marinum的16S rRNA基因序列几乎相同(99.9%)； 菌株R-1-R-7-1和R-4-H-7同分离自韩国黄海滩涂的近海游动球菌Planococcus maritimus系统发育关系最近(相似性分别是 99.64%, 99.58%)；菌株R-1-R-11同分离自韩国东海Hwajinpo海滩海水的花津滩芽孢杆菌(Bacillus hwajinpoensis)的 16S rRNA基因序列相似性为99.6%[14]。

拟杆菌门(Bacteroidetes)细菌在海洋中分布也十分广泛, 并且在很多水体和海洋沉积物中有较高的丰度, 很多拟杆菌能产生各种各样的胞外水解酶,经常与藻类形成共生关系, 还可以在大型海洋生物表面或内部生长[15]。本研究发现共有 8个菌株属于拟杆菌门, 其中R-3-M-5-2属于圆杆菌科(Cyclobacteriaceae)的食冷菌属(Algoriphagus), 它同分离自日本海绿藻Acrosiphonia sonderi的维氏嗜冷菌Algoriphagus winogradskyi[16]的16S rRNA基因序列相似性为100%, 可能为同一菌株。其余7株菌均属于黄杆菌科(Flavobacteriaceae), 其中菌株 R-1-M-5A同分离自日本海红藻(Polysiphonia japonica)的多管藻海状杆菌(Maribacter polysiphoniae)[17]的系统发育关系最近, 16S rRNA基因序列相似性为99.9%； 菌株 R-4-R-7同分离自日本海海水样品的居水海菌(Maribacter aquivivus)的16S rRNA基因序列相似性为99.4%； 菌株R-3-M-8同分离自韩国褐藻的水域华美菌(Formosa undariae)的16S rRNA基因序列相似性为 99.2%； 菌株 R-1-R-2同分离自日本海 Troitsa湾海胆(Strongylocentrotus intermedius)的米氏海藻杆菌(Algibacter mikhailovii)的16S rRNA基因序列相似性为99.6%； 而菌株R-2-R-3-1同分离自韩国Gangjin湾海水的港津极地杆菌(Polaribacter gangjinensis)的16S rRNA基因序列的相似性只有94.2%, 依据现行国际细菌分类规则, 极有可能是不同于极地杆菌属(Polaribacter)的一个潜在新属。

3 讨论

各种特殊生态环境是获取微生物新种质资源的有效途径, 也是进行微生物新型生物活性物质研发的基础。本研究采用常规2216E培养基以及R2A、M1两种寡营养培养基, 首次对俄罗斯库页岛潮间带沉积物的可培养细菌进行了分离, 并做了基于 16S rRNA基因序列分析的系统发育多样性研究。从培养分离效果来看, 常规 2216E培养基所分离菌株的多样性要稍高于R2A和M1寡营养培养基。从系统发育分析结果来看, 所选择的45株菌共分布于6个纲、27个属、44个种。其中以变形菌门为优势菌群, 占45株代表菌株的 42.2%； 而分布于放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的细菌所占比例基本相当, 分别20.0%、20.0% 和 17.8%。这些菌株大部分与分离自日本和韩国近海的细菌在系统发育关系上非常接近,推测它们有可能是通过海水环流等因素在太平洋北部海域之间进行扩散所致。另外我们还从分离菌株中发现有 8株菌(R-1-H-3、R-4-M-3、R-1-R-9、R-2-R-1、R-1-M-4-1、R-2-M-13、R-4-M-5、R-4-H-33)与相应关系最近的标准模式菌株的 16S rRNA基因序列相似度在97.3%～98.3%, 1个菌株(R-2-R-3-1)的相似度为 94.2%。按照以往国际细菌分类通用规则,16S rRNA基因序列相似度＜97.0%和＜95.0%分别是确定新种群与新属的必要前提之一[18]。然而由于16S rRNA基因序列的局限性, 在某些特殊情况下(如菌株具有比较明显的生理、生化、生态特征,DNA-DNA杂交结果与16S rRNA基因序列比对结果互不相符等情况), 这一规则被人们进行不同程度地重新考量[5-6]。综合近些年IJSEM上发表的新种、属文献, 并根据Mincheol Kim等人[19]2014年对细菌种间 16SrDNA序列相似性的最新研究标准(即 16S rRNA 基因序列相似度＜98.5%的菌株均具有成为新种的可能)。我们认为上述8株菌有成为潜在新种的可能, 而菌株R-2-R-3-1也已满足成为新属的必要条件之一, 当然这尚需DNA-DNA杂交、G+C mol%、生理生化表性特征等多项分类数据进行相互印证后方可确定。本研究表明俄罗斯库页岛潮间带沉积物中细菌具有非常高的物种多样性, 该结果可为进一步研究海洋细菌的区域性生物地理学提供有益参考。

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