两对头孢菌素类抗生素异构体的质谱识别研究

朱培曦，贾 飞，陈 悦，陆静娴，潘芳芳，李会林，郑金琪，蒋可志，林 琼（.浙江省食品药品检验研究院，浙江杭州 0004；.杭州师范大学有机硅重点实验室，浙江杭州 ；.浙江工业大学化学工程与材料学院，浙江杭州 004）

两对头孢菌素类抗生素异构体的质谱识别研究

朱培曦1，贾 飞1，陈 悦1，陆静娴1，潘芳芳1，李会林1，
郑金琪1，蒋可志2，林 琼3
（1.浙江省食品药品检验研究院，浙江杭州 310004；2.杭州师范大学有机硅重点实验室，浙江杭州 311121；
3.浙江工业大学化学工程与材料学院，浙江杭州 310014）

采用电喷雾四极杆飞行时间质谱技术对头孢他啶及Δ3异构体，头孢曲松Z／E异构体进行了分析研究，并使用离子阱质谱技术对头孢他啶的碎裂途径进行了确认。头孢他啶质子化离子容易丢失CO或CO2而形成碎片离子m／z440、424、396；由于双键与六元环上硫原子相连，头孢他啶Δ3异构体容易发生开环反应，产生特征碎片离子m／z313。头孢曲松Z异构体中，酰胺键氮上的氢容易与肟基上的氧原子形成分子内氢键，所对应的碎片离子m／z324较稳定，丰度较高；而头孢曲松E异构体中，酰胺键氮上的氢却与肟基上的N原子形成分子内氢键，促进其进一步发生丢失甲氧基碎裂，形成碎片离子m／z293和m／z112。上述特征碎裂可用于这两类异构体的质谱识别，也可为类似样品中异构体杂质的分离鉴定提供数据支持。

头孢他啶；头孢曲松；异构体区分；质谱识别；正离子

头孢菌素是一类广谱半合成抗生素，具有抗菌谱广、抗菌活性强、疗效高、耐酸、耐碱、耐β-内酰胺酶、低致敏、副作用小等优点［1-3］。头孢他啶和头孢曲松为第三代头孢菌素，在耐β-内酰胺酶、抗革兰阴性菌及抗菌谱等方面的性能比第二代更优越。由于在合成或保存过程中，头孢菌素类药物容易产生各种异构体杂质，如Δ3异构体和顺反异构体等［4］，而异构体杂质与药物主成分的结构较为接近，是药品中杂质鉴定的难点，因此，通过对异构体杂质裂解规律的总结，可以为未知杂质结构的推导提供实验依据。

自20世纪80年代以来，人们就一直尝试使用质谱技术对异构体分子进行鉴定和区分［5-6］，且随着软电离技术的发展，出现了许多使用电喷雾质谱技术对各种异构体进行区分的报道［7-15］。头孢菌素类药物是广泛使用的抗生素药物，已有文献对其质谱裂解行为进行了总结［16-19］，并且尝试对盐酸头孢吡肟、盐酸头孢甲肟、头孢泊肟酯等药物的Z／E异构体或Δ2／Δ3异构体进行鉴定［20-22］。

头孢丙烯和中间体7-氨基-3-丙烯基-4-头孢烷酸（7-APRA）的裂解规律已有报道［23］。头孢他啶的Δ2／Δ3异构体和头孢曲松的Z／E异构体的结构式示于图1。本工作拟采用四极杆飞行时间质谱技术对其进行区分，旨为直接使用液相色谱-质谱技术分离鉴定类似样品中的异构体杂质提供数据支持。

图1 头孢他啶（a）、头孢他啶Δ3异构体（b）、头孢曲松（c）和头孢曲松E异构体（d）的化学结构Fig.1 Chemical structures of ceftazidime（a），Δ3isomer（b），ceftriaxone（c）and ceftriaxone E isomer（d）

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

6538四极杆飞行时间质谱仪、6320离子阱质谱仪：美国Agilent公司产品；KDS-100-CE流动注射泵：美国KD Scientific公司产品。

头孢他啶和头孢曲松对照品：由中国食品

药品检定研究院提供；头孢他啶Δ3异构体和头孢曲松E异构体：美国药典标准品；甲醇（色谱纯）：美国Merck公司产品；超纯水：美国Millipore公司产品。

1.2 质谱条件

1.2.1 四极杆飞行时间质谱仪 电喷雾离子源，正离子模式，毛细管电压4 000V，毛细管温度300℃，雾化气压力241.325kPa，干燥气流速600L／h，质量扫描范围m／z 50～1 000，碰撞气为N2，流动泵进样速度180μL／h。质谱数据采集模式为Extended Dynamic Range （2GHz），正离子模式下，m／z 121.050 8和m／z922.009 8作为内标离子，实时对样品测定结果进行校正；LC／MS数据采用Mass Hunter Qualitative Analysis B.04.00软件分析。

1.2.2 离子阱质谱仪 电喷雾离子源，正离子模式，毛细管电压4 000V，毛细管温度250℃，雾化气压力206.85kPa，干燥气流速600L／h，质量扫描范围m／z 50～1 000，碰撞气为He，流动泵进样速度500μL／h。

1.3 样品处理

精密称取各对照品0.010g，置于200mL

容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀释至刻度，经0.45μm滤膜过滤，作为测试溶液。

2 结果与讨论

2.1 头孢他啶及其Δ3异构体的质谱区分研究

正离子模式下，头孢他啶及其Δ3异构体的二级质谱图示于图2。头孢他啶经电喷雾电离容易形成质子化离子［A＋H］＋（m／z 547），其二级质谱图示于图2a，其中基峰离子m／z 468是由母离子［A＋H］＋失去一分子吡啶形成的。碎片离子m／z 468可进一步丢失一分子CO或CO2，形成二级碎片离子m／z 440或m／z424；碎片离子m／z 396可由二级离子m／z440丢失一分子CO2或由二级离子m／z424丢失一分子CO形成；碎片离子m／z 396可再丢失一分子NH3和一分子末端羧基基团形成碎片离子m／z 277；碎片离子m／z 167则可由碎片离子m／z396断裂羰基与肟基相连的单键形成。头孢他啶的碎裂途径示于图3，该断裂方式与文献报道的一致［24］，并采用多级质谱进行确证，示于图4。同时，上述碎片离子的元素组成均得到高分辨质谱数据的确证，结果列于表1。

在头孢他啶Δ3异构体的二级质谱图中，［B＋H］＋同样容易丢失一分子吡啶形成碎片离子m／z468（基峰），示于图2b。与［A＋H］＋不同的是，［B＋H］＋在碎裂过程中不易产生碎片离子m／z 440、424和396，却容易形成碎片离子m／z313，该特征碎裂可作为这对异构体的质谱识别。在［B＋H］＋结构中，六元环上的双键与S原子相连，碎片离子a（m／z468）在正电荷的诱导下发生六元环的开环反应形成异构体b；由于羧基官能团上羰基氧原子亲核进攻，结构b发生闭环反应形成异构体c；并继续发生质子迁移形成结构d；由于电荷诱导，相邻的酰胺O发生闭环反应产生结构e；由于芳构化作用，结构e发生四元环开环反应产生碎片离子m／z313。由此可见，Δ3异构体结构中的双键与硫原子相连，从而引发形成碎片离子m／z 313的特征碎裂反应，其裂解途径示于图5。根据谱图中特征碎裂离子的显著差异，这对异构体的质谱识别可以实现。

图2 四极杆飞行时间质谱仪采集的头孢他啶（a）及其Δ3异构体（b）准分子离子的MS2质谱图（12V）Fig.2 MS2 spectra of protonated ceftazidime（a）andΔ3isomer（b）acquired by Q-TOF MS（12V）

图3 头孢他啶可能的碎裂途径Fig.3 Possible fragmentation pathways of ceftazidime

表1 头孢他啶和头孢曲松的高分辨质谱数据Table 1 Accurate mass measurements of ceftazidime and ceftriaxone

续表1

图4 离子阱质谱仪采集的头孢他啶准分子离子的MSn质谱图Fig.4 MSn spectra of protonated ceftazidime acquired by ion trap MS

图5 头孢他啶Δ3异构体（m／z 313）可能的裂解途径Fig.5 Possible fragmentation pathways of ceftazidimeΔ3isomer（m／z 313）

2.2 头孢曲松Z／E异构体的质谱区分研究

电喷雾正离子模式下，头孢曲松Z／E异构体的二级质谱图示于图6。头孢曲松容易产生质子化离子［C＋H］＋，其二级质谱图示于图6a，母离子［C＋H］＋（m／z 555）容易发生C—S键断裂而形成碎片离子m／z 396（基峰）。与头孢他啶类似，头孢曲松的碎片离子m／z 396分别丢失一分子CO或CO2，形成二级碎片离子m／z368或m／z352；而三级碎片离子m／z324则由离子m／z 368丢失一分子CO2或由离子m／z352丢失一分子CO形成，裂解途径示于图7a。上述碎片离子的化学式均得到高分辨质谱数据的确证，结果列于表1。

对比头孢曲松Z／E异构体的二级质谱图可以发现，Z异构体［C＋H］＋在碎裂过程中容易形成碎片离子m／z 324，E异构体［D＋H］＋却容易形成碎片离子m／z 293和m／z 112，因此二者异构体可实现质谱区分，其二级质谱图示于图6b。其中，E异构体中的碎片离子m／z 293可以由碎片离子m／z324进一步丢失甲氧基自由基产生。在Z异构体结构中，酰胺键的氮原子上的H原子容易与肟基上的O原子形成较稳定的分子内氢键（六元环），故碎片离子m／z324较稳定，相对丰度较高；而在E异构体结构中，酰胺键的氮原子上的H原子却与肟基上的N原子形成分子内氢键（五元环），故进一步促进了碎片离子m／z 324丢失甲氧基，形成相对丰度较高的碎片离子m／z 293，其裂解途径示于图7b。上述区分与头孢吡肟Z／E异构体的相似［20］。

图6 四极杆飞行时间质谱仪采集的头孢曲松Z异构体（a）和E异构体（b）准分子离子的MS2质谱图（10V）Fig.6 MS2 spectra of protonated ceftriaxone Z isomer（a）and E isomer（b）acquired by Q-TOF MS（10V）

图7 头孢曲松Z异构体（a）和E异构体（b）准分子离子可能的碎裂途径Fig.7 Possible fragmentation pathways of protonated ceftriaxone Z isomer（a）and E isomer（b）

3 结论

本工作采用四极杆飞行时间质谱技术对头孢他啶及其Δ3异构体，以及头孢曲松Z／E异构体进行碎裂研究，并使用离子阱质谱技术对头孢他啶的碎裂途径进行验证。由于双键位置产生移动，导致了头孢他啶及其Δ3异构体六元环稳定性的差异，产生了各自特征的质谱碎裂模式。头孢曲松Z／E异构体可以形成不同的分子内氢键，导致碎片离子的稳定性不同，且区分较为明显。上述结果表明，由于空间结构不同，导致头孢菌素异构体的裂解方式或难易程度不同，从而在二级质谱图中表现出明显的差异。因此，可以使用质谱技术对异构体进行有效地区分，该结果也可为类似样品中异构体杂质的分离鉴定提供实验数据支持。

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Differentiation of Two Pairs
of Cephalosporins Isomers by Mass Spectrometry

ZHU Pei-xi1，JIA Fei1，CHEN Yue1，LU Jing-xian1，PAN Fang-fang1，LI Hui-lin1，ZHENG Jin-qi1，JIANG Ke-zhi2，LIN Qiong3
（1.Zhejiang Institute for Food and Drug Control，Hangzhou310004，China；
2.Key Laboratory of Organosilicon Chemistry and Material Technology，Hangzhou Normal University，Hangzhou311121，China；3.College of Chemistry Engineering and Material Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou310014，China）

Two pairs of cephalosporins isomers，includingΔ2／Δ3isomer of ceftazidime and Z／E isomer of ceftriaxone，were discriminated by electrospray quadrupole-time-offlight mass spectrometry（ESI-Q-TOF MS）.In addition，the fragmentation characters of cephalosporins were identified by ion trap mass spectrometry.The protonated ceftazi-dime is found to facilely undergo fragmentation vialosing CO or CO2to afford the fragment ions at m／z440，424and 396；in contrast，fragmentation of itsΔ3isomer readily leads to the fragment ion at m／z313 viathe ring-opening reaction initiated by the positive charge on the double bond.For the protonated ceftriaxone，the amide group is facile to interact with the oxygen atom of the oxyimino group viaan intramolecular hydrogen bond in the structure of the Z isomer，thereby its fragment ion at m／z 324shows high abundance.Whereas，there is an intramolecular hydrogen bond between the amide group and the nitrogen atom of the oxyimino group in the structure of its E isomer，which facilitates the loss of methoxyl group to form the fragment ions at m／z 293and m／z112.These different fragmentation patterns can be used to discriminate the two pairs of isomers.This work can also contribute to differentiation and characterization of the potential isomeric impurities of cephalosporins.

ceftazidime；ceftriaxone；isomer differentiation；mass spectrometry；positive ions

O657.63

A

1004-2997（2015）04-0350-09

10.7538／zpxb.youxian.2015.0021

2014-09-04；

修回日期：2014-10-26

国家自然科学基金青年基金项目（21205025）；浙江省科技厅分析测试科技计划项目（2013C37055，2014C37059）资助

朱培曦（1984—），男（汉族），浙江杭州人，主管药师，从事化学药品质量研究工作。E-mail：zhpx110＠126.com

蒋可志（1980—），男（汉族），浙江永嘉人，副研究员，从事有机质谱研究工作。E-mail：jiangkezhi＠hznu.edu.cn

时间：2015-05-26；

网络出版地址：http：∥www.cnki.net／kcms／detail／11.2979.TH.20150526.0905.005.html