PIK3CA 蛋白表达异常与宫颈病变的关系

郭欣宇，毕娜，欧阳玲

(1.沈阳医学院附属第二医院妇科，辽宁 沈阳 110002;2.中国医科大学附属盛京医院麻醉科)

宫颈癌是妇科最常见恶性肿瘤，在人乳头状瘤病毒(HPV)感染的100 多种亚型中，约有10余种与宫颈癌相关。宫颈鳞状细胞癌大约占女性宫颈恶性肿瘤的80%～90%［1］。近年来国外研究证实PIK3CA 基因是宫颈癌的癌基因。本研究探讨宫颈病变组织中PIK3CA 基因的表达情况，探讨宫颈癌的发生、发展和转移中的过程中PIK3CA mRNA 的作用，为明确宫颈癌的演变过程，为进一步确定宫颈癌的发病机制，做好三级预防提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2001 至2012年在我院治疗的宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)90例(CINⅠ，Ⅱ，Ⅲ各30例)，年龄22～61 岁，平均年龄(49 ±5.2)岁;宫颈鳞癌60例(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ各20例)，年龄28～84 岁，平均年龄(60 ±2.1)岁;另选择因卵巢病变切除子宫的正常宫颈组织10例作为对照组，年龄21～65岁，平均年龄(54 ±3.3)岁。所有标本均在未经任何治疗的患者离体标本中取得。宫颈癌的诊断及分期，由有诊断资质的2 名病理科医生共同完成，参照国际妇产科联盟(FIGO)分期。本研究经本院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 试剂 PIK3 mRNA 原位杂交检测试剂盒(博士德生物工程有限公司);二氨基联苯胺(DAB)显色剂(福州迈新生物技术有限公司);3%过氧化氢溶液(自行配制)。

1.2.2 原位杂交法检测PIK3CA mRNA 先将不同分组的离体组织用石蜡固定包埋，连续切成4 μm厚的薄片，将每张切片用二甲苯进行脱蜡处理，用纯净水清洗去除内源性过氧化物酶，37 ℃恒温杂交过夜，加入封闭液(37 ℃30 min)，加入链霉亲和素－生物素复合物SABC (37 ℃恒温箱30 min)，DAB 显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，用树胶封片后显微镜下观察。用已知PIK3CA mRNA 阳性的宫颈鳞癌切片作为阳性对照，室温下以磷酸盐缓冲液(PBS)作为阴性对照。

1.3 统计学方法 采用EPIData 3.1 建立数据库，采用SPSS 17.0 进行统计学处理，组间比较采用t检验、方差分析及精确概率法。

2 结果

2.1 宫颈病变组织中PIK3CA mRNA 表达情况PIK3CA 蛋白的阳性表达产物定位于宫颈病变组织上皮细胞的胞浆中，颗粒呈棕黄色或棕褐色。宫颈鳞癌组织中的PIK3CA mRNA 表达水平与正常宫颈组织和宫颈轻、中度不典型增生组织差异有统计学意义(t=4.397，P ＜0.01);PIK3CA mRNA 在宫颈癌组与CINⅢ组比较(t=2.971，P ＜0.01)，以及CINⅡ/CINⅠ组与正常宫颈上皮组比较(t=4.097，P＜0.01)，差异均有统计学意义。见表1。

2.2 PIK3CA mRNA 表达与宫颈鳞癌临床病理参数的关系 宫颈鳞癌Ⅰ、Ⅱ期组织PIK3CA mRNA表达水平与Ⅲ期比较差异有统计学意义(t=－5.940、－5.229，P ＜0.01);PIK3CA mRNA 表达水平在高分化和中、低分化宫颈鳞癌组织比较差异有统计学意义 (t=－ 5.422，P ＜0.01);PIK3CA mRNA 表达在有淋巴结转移组和无淋巴结转移组间比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。

表1 宫颈病变组织中PIK3CA mRNA 表达情况

表2 PIK3CA mRNA 表达与宫颈鳞癌临床病理参数的关系

3 讨论

宫颈癌在女性恶性肿瘤中仅次于乳腺癌，位居第2 位，约占女性生殖道肿瘤的1%～5%［1］。近年来，CIN 的发病率在年轻女性中不断上升是导致其高发的主要原因［1］。宫颈癌中以鳞癌为主，占80%～90%，而且宫颈癌的患者易发尿潴留、输尿管漏、淋巴囊肿等并发症，甚至可能造成严重的功能障碍，虽然经过手术、放疗可能缓解患者不同程度的症状，但仍可以造成患者躯体及心理健康。所以，目前查找宫颈癌发生发展的主要原因，明确其发病机制，对宫颈癌的三级预防具有积极的推动作用。

3.1 PIK3CA 的发生及与肿瘤的关系 PIK3CA 基因是1994年由Vilonia等通过原位杂交技术获得的癌基因。PIK3CA 基因在人类的消化系统、呼吸系统、生殖系统等组织中均有表达［2－5］，反映了它与人体细胞的正常生理变化及基本功能均有密切关系［6］。PIK3CA 以基因扩增或点突变等形式激活时，可以加速促进细胞生长与增殖及最大限度抑制细胞的凋亡，引起细胞调节失衡，最终导致肿瘤的发生。

3.2 PIK3CA mRNA 表达在不同发展阶段宫颈病变组织中的临床意义 本研究结果表明:宫颈鳞癌组织中的PIK3CA mRNA 表达水平与正常宫颈组织和宫颈轻、中度不典型增生组织差异均有统计学意义(P ＜0.01);PIK3CA mRNA 在宫颈癌组与CINⅢ组，以及CINⅡ/CINⅠ组与正常宫颈组织之间差异均有统计学意义(P ＜0.01)。宫颈鳞癌的PIK3CA mRNA 表达水平明显高于后两者，CINⅡ/CINⅠ组PIK3CA mRNA 表达水平明显高于正常的宫颈组织。证明PIK3CA mRNA 的表达水平与宫颈鳞癌的发生发展有紧密的联系。说明PIK3CA mRNA 表达在宫颈鳞癌临床分期及组织学分化程度的各组间比较差异有统计学意义，而在有无淋巴结转移组间比较差异无统计学意义。进一步表明PIK3CA mRNA 表达水平与宫颈鳞癌的严重程度密切相关。以上表明PIK3CA mRNA 可能参与了宫颈癌的发生、发展及演变加重的全过程。

目前本研究已从PIK3CA mRNA 表达水平发现其在宫颈鳞癌的发生发展过程中起到至关主要的作用。未来将在分子生物水平检测PIK3CA 蛋白来判断宫颈病变的发生发展及宫颈鳞癌的早期诊断、早期预防、预后评估，治疗方案的调整等。近年来由于广泛的HPV 筛查，证明HPV16、18、33等高危型HPV 可以通过激活PI3K/Akt 通路促进宫颈癌的发生［7］。染色体拷贝数目增加的频率与宫颈癌关系密切，发现 PIK3CA 定位于染色体3q26.3［8］。Bertelsen等［9］使用RT-PCR 同样证明了在40例宫颈肿瘤组织中有28例PIK3CA 拷贝数成3 倍多扩增。这表明PIK3CA 蛋白通过染色体拷贝数目增加及基因扩增在HPV 的影响下进一步发展成为宫颈癌。下一步将继续研究如何利用基因扩增来抑制宫颈癌的发生发展及转归。

［1］乐杰.妇产科学［M］.7 版.北京:人民卫生出版社，2008:263－268.

［2］Woenckhaus J，Steger K，Werner E，et al.Genomic gain of PIK3CA and increased expression of p110alpha are associatedwith progression of dysplasia to invasive squamous cell carcinoma［J］.J Pathol，2002，198(3):335－342.

［3］Barbareachim B.Different prognostic roles of mutations in the helical and kinase domains of the PIK3CA gene in breast carcinomas ［J］.Clin Cancer Res，2007，13 (20):6064－6069.

［4］Carson JD，Vanaller G，Lehr R，et al.Effects of oncogenic p110alpha subunitmutations on the lipid kinase activity of phosphatidyli nositol 3-kinase［J］.Biochem J，2007，98 (12):1881－1888.

［5］Zhang L，Huang J，YANG N，et al.Integrative genomic analysis of phosphatidylinositol 3-kinase family identifies PIK3R3 as a potential therapeutic target in epithelialovarian cancer［J］.Clin Cancer Res，2007，13 (18):5314－5321.

［6］Ma YY，Weis J，Lin YC，et al.PIK3CA as an oncogene in cervical cancer ［J］.Oncogene，2000，19 (23):2739－2744.

［7］Kim SH，Juhnn YS，Kang S，et al.Human papillomavirus 16 E5 up-regulates the expression of vascular endothelial growth factor through the activation of epidermal growth factor receptor，MEK/ ERK1，2 and PI3K/Akt［J］.Cell Mol Life Sci，2006，63 (7－8):930－938.

［8］Rao PH，Arias-Pulido H，Lu XY，et al.Chromosomal amplifications，3q gain and deletions of 2q33-q37 are the frequent genetic changes in cervical carcinoma［J］.BMC Cancer，2004，4 (1):5－13.

［9］Bertelsen BI，Steine SJ.Molecular analysis of the PI3K-AKT pathway in uterine cervical neoplasia:frequent PIK3CA amplification and AKT phosphorylation［J］.Int J Cancer，2006，118(8):1877－1883.