多发性骨髓瘤患者外周血清中microRNA－181a和microRNA－20a表达水平的检测及其临床意义

彭 晶，袁瑞丽，王晓琴，吴 锋，郭 炫

（1.西安交通大学医学院，陕西 西安 710061；2.西安交通大学医学院第一附属医院检验科，陕西 西安 710061；3.西安交通大学医学院医学研究生教学实验中心，陕西 西安 710061）

microRNA （miRNA，miR－）是一类内源性短链非编码的单链RNA，长度约为22个氨基酸，作用机制是microRNA与其靶mRNA的3′UTR区互补，当部分配对时阻碍靶mRNA的翻译，当完全配对时可使靶mRNA降解，参与细胞增殖、凋亡、细胞分化、发育和逆境应答等多种生物学过程［1］。多发性骨髓瘤 （multiple myeloma，MM）是一种由浆细胞克隆性增生的血液系统恶性肿瘤。研究［2－4］发现：一些microRNA可能参与 MM疾病的发生过程，并在MM中发挥致癌和抑癌的作用。研 究［5］发 现：microRNA－181a 是 造 血 相 关microRNA，在急性粒细胞白血病不同亚型中microRNA－181a的表达水平不同。Chen等［6］研究发现：microRNA－181a在B淋巴细胞转化过程中起重要作用。另有研究［7］显示：microRNA－181a在MM患者外周血清中高表达。目前有关microRNA－181a与MM关系的研究较少，尤其有关MM预后等方面的研究少见报道。Lionetti等［8］发现：microRNA－20a在MM中高表达，但亦有研究［9］显示：microRNA－17～92簇在 MM 血浆中低表达。Xiao等［10］报道：microRNA－17～92簇可促进淋巴细胞增殖。microRNA－20a作为 microRNA－17～92簇中的一员，在MM中发挥致癌还是抑癌作用，尚有待于进一步研究。本研究探讨microRNA－181a和 microRNA－20a在 MM 患者血清中的表达及其临床意义，并初步探讨其与MM发病的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 所有病例均为2013年1月—2014年5月于西安交通大学第一附属医院血液科住院的患者，正常对照者为西安交通大学第一附属医院查体中心同期健康体检者。将病例组分为MM组和其他血液病组。所有MM患者均符合《血液病诊断和疗效标准》中MM诊断标准且均经临床医师确诊，并排除心、肺和肝脏等其他器官衰竭且病情稳定者。MM组患者32例，平均年龄（62±2）岁，其中男性21例，女性11例；其中初诊14例，复发／难治18例。其他血液病组选择无MM病史的血液科其他恶性肿瘤患者12例 （均符合 《血液病诊断和疗效标准》），平均年龄 （57±4）岁，其中男性8例，女性4例；非霍奇金淋巴瘤4例，急性非淋巴细胞白血病3例，急性淋巴细胞白血病2例，慢性粒细胞白血病2例，慢性淋巴细胞白血病1例。正常对照组选择与病例组年龄、性别相配匹并经过常规体检合格者20人，平均年龄 （58±3）岁，其中男性14人，女性6人。

1.2 主要试剂和仪器 BLOODmisi全血 （液体样本）microRNA快速提取试剂盒、microRNA firststrand cDNA synthesis Kit和 microRNA Real－Time PCR Assay Kit（北京艾德莱生物科技有限公司），引物 （北京奥科鼎盛生物科技有限公司），白蛋白 （ALB）、乳酸脱氢酶 （LDH） （日本和光纯药工业株式会社），血清游离轻链 （FLC）（德国西门子公司），血清 M 蛋白 （法国西比亚公司），β2微球蛋白 （β2－MG） （宽范围） （潍坊三维生物工程集团有限公司）。Bio－CFX96定量PCR仪 （美国Bio－Rad公司），LABOSPECT008全自动生化分析仪 （日本日立公司），BNⅡSystem全自动蛋白分析仪 （德国西门子公司），Sebia－2毛细管电泳分析仪 （法国西比亚公司），FM－2000γ免疫计数器 （西安凯普机电有限责任公司）。

1.3 血清的分离与保存 收集MM组、其他血液病组和正常对照组研究对象的新鲜血清于无菌无酶的EP管中，4℃离心机，12000×g离心5min。吸上清于新的无菌无酶EP管中 （去除红细胞残骸）。所有标本分2份，一份用于PCR检测，另一份用于生化检测，－80℃保存。

1.4 microRNA的提取和microRNA－181a 和microRNA－20a表达检测 按照BLOODmisi全血（液体样本）microRNA快速提取试剂盒说明书提取血清 microRNA。按照 microRNA first－strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书 ［加poly（A）尾法］进行反转录。以上述合成的cDNA为模板，U6为内参，按照microRNA Real－time PCR Assay Kit试剂说明书在Bio－CXF定量PCR仪上进行扩增。microRNA－181a的 上游引物为 5′－AACATTCAACGCTGTCGGTGAGT－3′， microRNA－20a的上游引物为5′－GCGCTAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAG－3′，microRNA－181a／20a 的下游共用引物由microRNA Real－Time PCR Assay Kit试剂盒提供。U6－F为 5′－CTCGCTTCGGCAGCACA－3′， U6－R 为 5′－AACGCTTCACGAATTTGCGT－3′。设定反应条件如下：94℃预变性3min；94℃、20s，60℃、40s，45个循环。然后进行溶解曲线扩增。实验结束后进行溶解曲线分析，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定产物的特异性。采用2－△CT计算microRNA－181a 和microRNA－20a的相对表达水平，U6作为内对照，△CT＝目的基因的CT－内参基因的CT。2－△CT的值越高，表明相对表达水平越高。

1.5 血清肿瘤负荷指标及M蛋白电泳 采用1.2中试剂及仪器测定血清肿瘤负荷指标：ALB水平、LDH活性、FLC及血清β2－MG水平，并测定 M蛋白百分比。所有检测均在室内质控在控下进行，数据可靠。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。血清ALB水平、LDH活性、FLC及β2－MG水平符合正态性分布，结果以表示。M蛋白百分比、microRNA－181a 和microRNA－20a表达水平为非正态分布资料，以中位数和四分位数间距［M （P25－P75）］表示。microRNA－181a和 microRNA－20a表达水平组间比较采用Kruskal－Wallis或 Wilcoxon秩和检验，microRNA－181a和 microRNA－20a表达水平与血清肿瘤负荷指标及M蛋白百分比变量间的关系分析采用Spearman线性相关分析。

2 结 果

2.1 microRNA－181a和 microRNA－20a扩增产物的溶解曲线及琼脂糖凝胶电泳 本实验构建的实时荧光定量检测microRNA－181a和 mirRNA－20a的方法特异性较好，溶解曲线分析未发现非特异性峰。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，只有1个目的条带。见图1和2。

图1 microRNA－181a和microRNA－20a及U6产物的溶解曲线Fig.1 Dissolution curves of microRNA－181a，microRNA－20aand U6products

2.2 microRNA－181a和 microRNA－20a在 MM 患者血清中的表达水平 MM组、其他血液病组和正常对照组研究对象血清中 microRNA－181a和microRNA－20a表达水平比较差异有统计学意义（H＝15.218，9.891；P＝0.000，0.007）。与正常对照组比较，MM组患者血清中microRNA－181a （Z＝－2.702，P＝0.005）和 microRNA－20a（Z＝－1.979，P＝0.048）表达水平比较差异有统计学意义。与其他血液病组比较，MM组患者血清中 microRNA－181a （Z＝－3.163，P＝0.001）和microRNA－20a （Z＝－2.722，P＝0.005）表达水平比较差异有统计学意义。与正常对照组比较，其他血液病组患者血清中 microRNA－181a（Z＝－1.735，P ＝0.093） 和 microRNA－20a （Z ＝－1.302，P＝0.220）表达水平比较差异无统计学意义。见表1。

图2 microRNA－181a和microRNA－20a及U6产物的电泳图Fig.2 Electrophoregram of microRNA－181a，microRNA－20aand U6products

表1 各组研究对象血清中microRNA－181a和microRNA－20a表达水平Tab.1 Expression levels of serum microRNA－181aand microRNA－20aof subjects in various groups ［M（P25－P75）］

2.3 microRNA－181a和 microRNA－20a表达水平与M蛋白百分比的相关性 采用Spearman线性相关分析，14例初诊患者的microRNA－181a和microRNA－20a表达水平与 M蛋白百分比均呈正相关关系。见表2。

2.4 血清中 microRNA－181a和 microRNA－20a表达水平与血清肿瘤负荷指标相关性 14例初诊患者的MM相关血清肿瘤负荷指标结果：FLC为（11.55±2.69）mg·L－1；ALB水平为 （30.68±1.75） g · L－1；LDH活性为（157.43 ±11.66）U·L－1；β2－MG水平为（4377.38±599.19）mg·L－1。将14例初诊患者 microRNA－181a和microRNA－20a表达水平与血清肿瘤负荷指标进行Spearman相关性分析，microRNA－181a与FLC和β2－MG呈正相关关系（r＝0.780，0.552；P＝0.001，0.041）。见表3。

表2 血清中microRNA－181a和microRNA－20a表达水平与M蛋白百分比相关性分析Tab.2 Correlation analysis on expression levels of serum microRNA－181a，microRNA－20aand M protein percentages

表3 血清中microRNA－181a和microRNA－20a表达水平与血清肿瘤负荷指标相关性分析Tab.3 Correlation analysis on expression levels of serum microRNA－181a，microRNA－20aand tumor loaded indexes

3 讨 论

研究［11］证实：microRNA参与了细胞生长发育过程中的多个环节，尤其是在肿瘤细胞的增殖、凋亡中起一定的调控作用。microRNA的调控作用在肝癌、肺癌、肠癌、胰腺癌和白血病等［12－16］多种恶性肿瘤中得到了证实。在MM的研究［17］中同样发 现 有 microRNA 的 参 与。 研 究［2］发 现：microRNA－21在 MM 中可通过靶基因 PTEN、Rho－B及BTG2来发挥其致癌基因作用；在研究黄连素对MM的治疗中发现：黄连素可降低microRNA－21表达水平，microRNA－21可使得靶基因IL－6／STAT3发生改变，并导致靶基因PDCD4表达上调，而后者又引发p53信号通路，最终使得肿瘤细胞发生凋亡［18］。

β2－MG主要由淋巴细胞生成，肿瘤细胞合成β2－MG的能力很强，β2－MG能反映细胞增殖、肿块大小以及肾功能损伤情况。LDH特异性低，但其可用于观察是否存在组织、器官损伤。ALB可间接地反映血清白细胞介素6（IL－6）的水平、肝功能和营养状况。FLC是免疫球蛋白的轻链，分为κ和λ2种形式，是近年来作为研究肿瘤疾病的新指标之一。β2－MG、LDH、ALB和FLC作为MM肿瘤负荷指标，可反映MM疾病的疗效及预后等。

本研究中 microRNA－181a在正常对照组、MM组和其他血液病组的表达水平分别为0.004、0.0452和 0.000。MM 患者血清中 microRNA－181a表达水平高于正常对照组，这与已往研究［7］结果一致。另外，MM 患者血清中 microRNA－181a表达水平与其他血液病组比较差异也有统计学意义，而其他血液病组患者microRNA－181a表达水平与正常对照组比较差异无统计学意义。由于临床指标 （ALB、LDH、FLC、β2－MG、M蛋白）在治疗后改变情况不一，本研究结果显示：将MM组患者血清中microRNA－181a／20a表达水平与临床指标进行相关性分析时相关性不及初诊病例，初诊病例用于临床指标的相关性研究对象更佳。本研究结果显示：microRNA－181a与M蛋白百分比呈正相关关系，血清M蛋白百分比现已是确诊 MM疾病的特异性指标之一。microRNA－181a与肿瘤负荷指标β2－MG和FLC呈正相关关系，提示microRNA－181a参与了 MM发病过程，对MM的诊断有一定的作用，且其水平的高低与肿瘤负荷有关，对疾病的预后有良好的预测效果。

microRNA－20a在正常对照组、MM组和其他血液病组的表达水平分别为1.159、5.879和0.072。与正常对照组和其他血液病组比较，MM组患者血清中microRNA－20a表达水平差异均有统计学意义。其他血液病组与正常对照组比较差异无统计学意义。此外，microRNA－20a与 M蛋白百分比相关性表现较 microRNA－181a更强，microRNA－20a和 microRNA－181a与 M 蛋白百分比相关系数 （r）分别为0.739和0.574，且r越接近1表明相关性越好，表明microRNA－20a对于MM的诊断更有价值。

本研究曾将MM组患者按D－S标准进行分期后，发现 microRNA－181a和 microRNA－20a表达水平在分期间比较差异无统计学意义。考虑研究对象过少的缘故，本文作者在以后的研究中将不断增加样本数，使所研究的对象更有代表性，研究结果更有说服力。

目前MM临床上表现为易复发、难治愈，这与缺乏良好的指标有关。本研究结果表明：microRNA－181a和 microRNA－20a均参与 MM 的发病过程，可作为 MM 的诊断标志物；microRNA－20a对 MM 诊断效果优于 microRNA－181a；microRNA－181a表达水平升高表明患者的预后不良。将二者作为MM的检测指标有助于对MM的诊断及预后判断。

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