mRNA降解与血痕遗留时间相关性探索

龙 兵,罗 杨,皮建华,周 豪

（1.四川警察学院 四川泸州 646000；2.泸州市公安局 四川泸州 646000）

案发时间的判断对于案件的侦破具有十分重要的意义。血痕是现场非常常见的生物物证，通常能够比较准确地反映案发时间。血痕遗留时间的推断一直是刑事科学技术领域研究的热点和难点[1-4]。

RNA是分子生物学领域的研究热点，同时受到法医学研究者的关注。许多研究报道机体组织RNA会随着死亡时间的延长而发生降解，降解与死亡时间具有一定的相关性[5-7]。这些研究大多以组织器官为研究对象，关于血痕RNA降解的研究相对较少。本次研究以管家基因β-actin和血液中特异性表达的HBB为目的基因，18s rRNA为内参基因，探讨血痕在离体72小时时间内mRNA的降解情况。

一、材料与方法

（一）样本。

采集6名个体静脉血（3名男性，3名女性），各1mL，EDTA抗凝。取20μL血液滴于吸水滤纸上，共制作42份样本，室温保存，分别于0.5h、2h、6h、12h、24h、48h、72h后提取RNA。

（二）仪器与试剂。

采用TRIzol试剂（美国Invitrogen公司）提取RNA。采用Bioneer逆转录试剂盒进行逆转录。实时定量PCR扩增采用的试剂盒为Roche公司FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)荧光定量试剂盒，扩增仪器为AB-7500实时定量PCR仪。

（三）方法。

1.RNA抽提。剪取制作的血痕于1.5mL离心管，加入0.5mLTRIzol试剂，室温下震荡混匀5min，加0.1mL氯仿，混匀，放置3min； 12000g离心15min；取上清，加入250μL异丙醇，混匀，12000g离心10min；弃上清，加入75%乙醇1mL，7500g离心5min。弃上清，短暂室温干燥，加入DEPC水溶解，-80保存。实验操作均在冰上进行，离心均为-4℃低温离心。

2.RNA逆转录。反应体系为5μL模板RNA,基因特异性逆转录引物浓度为20pmol，总反应体系为20μL。 反应条件为50℃保温1h，95℃变性5min。

表1 逆转录基因特异性引物

3.实时定量PCR。HBB、β-actin和18s rRNA的扩增引物见表2。实时荧光定量PCR扩增反应体系：5μL SYBR Green,前后引物终浓度均为0.5μM，总反应体系为10μL。

表2 HBB、β-actin和18s rRNA扩增引物

扩增条件为：

?

（四）数据分析。

以实时定量PCR的CT值进行统计学处理，分析软件为Excel2007、GraphPad Prism5。

二、结果

（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测PCR扩增片段，片段大小与预期大小相符合，见图1。

图1 PCR产物电泳图

从左至右分别为Marker、18s rRNA、β-actin、HBB。

（二）RNA降解与血痕遗留时间的相关性。

获得各样本实时定量PCR扩增CT值，HBB、18s rRNA、β-actin实时定量PCR扩增曲线见图2。

图2 实时定量PCR扩增曲线

从左至右分别为HBB、18s rRNA、β-actin。

以18s rRNA为内参计算ΔCT值，即ΔCT=CT（target mRNA）-CT(reference DNA)[8]，建立ΔCT值与血痕遗留时间的相关性。结果显示在72小时时间内，血痕β-actin、HBB基因mRNA具有较强的稳定性，mRNA降解与血痕遗留时间没有相关性（p＞0.05）。HBB、β-actin基因mRNA降解与血痕遗留时间的相关性见图3、图4。

图3 HBB基因mRNA降解与血痕遗留时间相关性（r=0.4325,p=0.3324）

图4 β-actin基因mRNA降解与血痕遗留时间相关性（r=0.3985,p=0.3759）

三、讨论

RNA在细胞内以多种形式存在，主要包括mRNA、tRNA、rRNA等。18s rRNA与核糖体蛋白紧密结合，受到核糖体蛋白的保护，稳定性强，不易发生降解[9]。许炎等[10]，在研究中发现血痕18s rRNA在8-15天都没有发生明显降解。研究中，我们以18s rRNA为内参对HBB和β-actin两个目的基因CT值进行标准化处理，能够更加准确的观察血痕mRNA的降解情况，更好的反映mRNA降解与血痕遗留时间的相关性。

许多研究报道机体死亡后细胞mRNA在数天甚至数小时内发生快速降解[7,11]。我们在研究中发现血痕HBB和β-actin基因mRNA在72小时时间内都保持了很强的稳定性，这与机体在死亡后细胞mRNA降解有很大差异。我们认为导致血痕mRNA降解速度慢的原因，一方面可能与血痕在滤纸上迅速干燥，RNA酶以及相关因子的活性降低有关；另一方面，可能与实验环境相对理想化，受到外界的污染相对较小有关。该研究涉及的血痕遗留时间相对较短，在以后的研究中，我们将进一步延长血痕遗留时间，同时探讨温度、湿度等因素对血痕RNA降解的影响。

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