海南岛南药根结线虫种类鉴定

符美英, 曾向萍, 芮 凯, 陈绵才

(海南省农业科学院农业环境与植物保护研究所, 海南省植物病虫害防控重点实验室， 海口 571100)



海南岛南药根结线虫种类鉴定

符美英, 曾向萍, 芮 凯, 陈绵才*

(海南省农业科学院农业环境与植物保护研究所, 海南省植物病虫害防控重点实验室， 海口 571100)

运用比较形态学、同工酶和mtDNA-PCR对采自海南岛9个市县的南药根结线虫进行种类鉴定,结果发现有南方根结线虫、象耳豆根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫和西班牙根结线虫等5种根结线虫危害海南岛南药。5种根结线虫均能在海巴戟上寄生与危害,而南方根结线虫寄主非常广泛,可危害大多数调查的药用植物。

南药植物; 根结线虫; 鉴定; 线粒体DNA

南药原指东南亚和非洲等地所产的药材。我国部分地区由于气候条件优越,有南药的异种、近缘种生长,蕴藏着丰富的药材资源。海南岛是我国两大南药生产基地之一,有药用植物资源3 000多种,其中南药30多种[1]。随着南药的产业化发展,很多南药植物得到了大规模种植,但是由于根结线虫病的危害,对这些药材的产量和品质均造成较大程度的影响。

根结线虫(Meloidogynespp.)是一类种类多、分布广、寄主广泛和危害极大的植物寄生性线虫。据有关资料报道,目前已描述的根结线虫有90多个种,广泛分布于世界各地,在35°S和35°N之间的地区分布最多[2]。在我国热带和亚热带地区,根结线虫病发生普遍,其种类大多是常见的4种根结线虫:南方根结线虫(Meloidogyneincognita)、花生根结线虫(M.arenaria)、爪哇根结线虫(M.javanica)和北方根结线虫(M.hapla),据近几年的调查,象耳豆根结线虫(M.enterolobii)已上升为我国南方常见根结线虫。根结线虫涉及寄主超过3 000种植物,分属于114个科。一般造成农作物减产10%～20%,严重的达75% 以上。常见的4种根结线虫最具有经济重要性,在根结线虫所引起的整个栽培作物的损失中,它们造成的损失占90%以上[3]。根结线虫对部分南药的危害非常大,对南药的产量和品质造成较大程度的影响,如海巴戟,调查显示海口、万宁、定安、儋州等地种植的海巴戟都严重感染根结线虫病,植株发病率达90%以上。

根结线虫在进入南药植物根系后,能引起寄主植物的一系列病变,如使根部细胞过度分裂、膨大,使根部畸形、肿大,形成结状物、瘤状物;根结线虫危害初期,南药植物地上部症状不明显,随着根结线虫的繁衍,受害的根系增多,地上部逐渐呈现出生长不良,长势衰弱,叶片从下往上逐渐呈现黄化、无光泽,叶片稀少,受害严重时,植株叶片脱落,最终黄化枯死[4]。由于根结线虫病的危害,南药药材的产量和品质受到严重的影响,经济损失巨大,生产者的积极性受到挫伤。因此本研究对海南南药进行调查采样,并对根结线虫进行种类鉴定,为南药植物的育种和根结线虫病的防治打下良好的基础。

1 材料与方法

1.1 根结线虫病调查及样本采集

在2013年2-7月,分4次分别从海南岛的海口、定安、万宁等9个市县的30个南药产区,用跳跃式的方法,采集南药植物根系及根周围5～20 cm深的耕作层土壤,涉及南药寄主有海巴戟、益智、槟榔、胡椒、高良姜、沉香、丁香、长春花等8种。采集时用5点取样法,样品用塑料袋包装并保湿,同时在标签和记录本上简要注明采集时间、地点、寄主名称、土壤类型和前茬作物等。挖取植株侧根,观察根部症状,根据根结的有无判定植株是否发病,统计发病率;依据根结分级标准[5],记载田间植株的发病程度。根结分级标准为:0级,无根结;Ⅰ级,有少数根结;Ⅱ级,大部分根上有根结;Ⅲ级,在根结上有再次根结;Ⅳ级,根结互相连结成为根结团块。

1.2 种群纯化保存

在解剖镜下,将田间采集的根结线虫原始种群接种在空心菜嫩根上,产卵后选取色泽黄、大而饱满的优质单卵块,接种到预先培养在消毒土壤中的空心菜幼嫩根尖部,在大棚中培养约42～56 d,适当浇水,注意保持土壤湿度,浇水时防止线虫被水冲淋到土壤下层,每隔20～30 d施复合肥1次。

1.3 形态学鉴定

取所采线虫种群的成熟雌虫,置于透明硬塑料板的蒸馏水滴中,用手术刀切下会阴部角质膜,用单根猪鬃制成的小毛笔将杂物清除干净并修剪成小的方形,将其移到载玻片上,做成临时标本在光学显微镜下观察会阴花纹特征并拍照,会阴花纹观察比较参照刘维志[6]。每个种群观察10～20头。

1.4 同工酶分析

运用常规聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对根结线虫纯化种群雌虫的酯酶进行电泳分析。电泳分析采用北京六一仪器厂生产的DYY-6B型电泳槽,7%分离胶和4%浓缩胶,胶厚1.0 mm,每孔加入10条纯化培养的年轻雌虫酶提取物,酯酶染色参照胡凯基[7]的方法。以已鉴定的爪哇根结线虫样本作为参照系。

1.5 分子生物学鉴定

1.5.1 DNA提取

参照万新龙的方法[8]稍作改进,用挑针将单头根结线虫雌虫从根结中挑出,放入200 μL的PCR管中;用枪吸取8 μL 的灭菌水置PCR管中,并用枪头将线虫虫体戳破,内含物溢出;再加入2 μL的5×裂解buffer(10×PCR buffer与1 000 μg/mL的蛋白酶K,按1∶1的体积比混合);将PCR管转移到-70 ℃冰箱中,冷冻30 min;将冷冻后的PCR管放置到PCR仪中,65 ℃ 1 h,95 ℃ 10 min;掌上离心机瞬时离心,上清液用于PCR扩增或放置-20 ℃冰箱中备用。

1.5.2 PCR扩增

参考廖金铃[9]的方法,采用引物#C2F3(5′-GGTCAATGTTCAGAAATTTGTGG-3′)和#1108(5′-TACCTTTGACCAATCACGCT-3′),分别扩增位于线粒体DNA中的COⅡ基因和lrRNA基因。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。对23个根结线虫纯化种群进行mtDNA-PCR扩增。采用25 μL反应体系:引物各1.0 μL,dNTP混合物0.5 μL(每一核苷酸为10 mmol/L),Mg2+1.5 μL, 10×PCR缓冲液2.5 μL,Taq酶0.5 μL,模板DNA 2.0 μL,无菌水ddH2O 16 μL。反应参数:94 ℃预变性4 min,然后94 ℃变性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,反应共35个循环,72 ℃延伸10 min。

取10 μL PCR产物在浓度为1.5%的琼脂糖凝胶上检测所扩增片段的大小,在凝胶成像系统照相和保存。

2 结果与分析

2.1 根结线虫危害情况和种群情况

从海南岛海口、文昌、琼海等9个市县的南药种植区调查并采集,涉及寄主8种,发现有些南药植物如海巴戟、沉香和长春花严重感染根结线虫病,其正常生长受到影响,产量降低,造成了一定的经济损失。所调查的30个南药种植地块中有23个地块感染根结线虫病,田块发病率为76.7%。其中海巴戟受根结线虫危害最严重,调查显示所有的海巴戟种植地都严重感染根结线虫病,植株发病率达90%以上,根结指数为Ⅱ级以上,见表1。

表1 南药根结线虫种类和种群危害情况

2.2 会阴花纹观察

南方根结线虫:会阴花纹变异较大,一般背弓高;花纹明显呈椭圆形或方形,背弓顶部圆或平,有时呈梯形,背纹紧密,背面和侧面的花纹从波浪形至锯齿形,有时平滑,侧区常不清楚,侧纹常分叉。

爪哇根结线虫:会阴花纹在群体内变异很大,通常为椭圆形至圆形,形成一个套一个的同心圆,背弓低到高,线纹平滑、细密、连续,有明显的侧线,很少有线纹通过侧线,也有些种群的侧线不明显。

花生根结线虫(酯酶为A2):会阴花纹变异较大,花纹明显呈椭圆形,一般背弓扁平到圆形,大多时候弓上的线纹在侧线处分叉,有明显的侧线,有线纹通过侧线,背面和侧面的花纹从波浪形至锯齿形,侧纹常分叉,有时纹断续并分叉;有些种群没有侧线。

花生根结线虫(酯酶为A1):会阴花纹较圆,一般背弓低到中等,圆形,线纹波浪状明显,有时候弓上的线纹在侧线处分叉,有明显的侧线,有线纹通过侧线,背面和侧面的花纹从波浪形至锯齿形,侧纹常分叉。

西班牙根结线虫:会阴花纹卵圆形至长方形,背弓通常较低,少数较高,背纹由纤细多波浪至平滑,腹面线纹通常细弱平滑,侧线明显多分叉,尾端和阴门区无线纹。

象耳豆根结线虫:会阴花纹近卵圆形,一般背弓低到中高,线纹细,由平滑至波浪状,尾尖区环纹不规则,侧线不明显,腹区环纹较平缓和细密。会阴花纹变化较大。

2.3 同工酶分析结果

对纯化培养的23个根结线虫种群的年轻雌虫的酯酶进行电泳分析(见图2)。经同工酶的特异性染色后,23个种群中,有11个种群的酯酶谱型为I2型,与已报道的南方根结线虫相同;有4个种群的酯酶谱型为J3型,与已报道的爪哇根结线虫相同;有2个种群的酯酶谱型为A2型,1个种群的酯酶谱型为A1型,与已报道的花生根结线虫的两种谱型相同;有1个种群的酯酶谱型为S2-M1型,与已报道的西班牙根结线虫相同;有4个种群的酯酶谱型为VS1-S1型,确定为象耳豆根结线虫(见表2)。

图1 南药根结线虫会阴花纹Fig.1 The perineal pattern of Meloidogyne spp.

图2 南药植物根结线虫种群酯酶电泳图Fig.2 Electrophoretogram of esterases (Est) in five Meloidogyne spp. on southern herbs

2.4 分子生物学分析

用引物#C2F3和#1108对纯化培养的23个根结线虫种群的COⅡ和lrRNA基因间序列进行扩增,结果见图3。南方根结线虫的11个种群的扩增片段为1.7 kb;爪哇根结线虫的4个种群的扩增片段为1.7 kb;花生根结线虫的2个种群(酯酶表型为A2)的扩增片段为1.1 kb,1个种群(酯酶表型为A1)的扩增片段为1.7 kb;西班牙根结线虫的1个种群的扩增片段为1.7 kb;象耳豆根结线虫的4个种群的扩增片段为0.7 kb。

3 结论与讨论

本研究在30个南药种植点调查了8种主要南药植物根结线虫病,采集样本经纯化培养获得23个根结线虫纯化种群。通过运用比较形态学、同工酶分析和分子生物学分析相结合的方法对海南岛南药植物上的23个根结线虫纯化种群进行鉴定,结果发现11个种群为南方根结线虫,4个种群为爪哇根结线虫,2个种群为花生根结线虫(酯酶表型为A2),1个种群为花生根结线虫(酯酶表型为A1),1个种群为西班牙根结线虫,4个种群为象耳豆根结线虫,由此可见南方根结线虫是海南岛南药植物优势根结线虫;其次为爪哇根结线虫和象耳豆根结线虫。与1994年吴影梅[10]等人报道不同之处是多了象耳豆根结线虫和花生根结线虫。在最近几年的跟踪调查中,发现象耳豆根结线虫在海南不仅危害南药,还严重危害海南岛的瓜菜类作物。花生根结线虫(酯酶表型A1)在南药植物上属首次发现,在我国其他作物上也比较少见,本次调查发现花生根结线虫(酯酶表型A1)对海巴戟的危害非常严重,根结指数为Ⅲ级,严重影响海巴戟的生长。

图3 南药植物根结线虫种群COⅡ和lrRNA基因间序列PCR扩增Fig.3 PCR amplified mtDNA of Meloidogyne spp. on southern herbs

在根结线虫的形态分类中,会阴花纹的分类价值一直被认为是最高的[11],但同一种根结线虫的不同种群的变异非常大,因此要求研究人员要有非常丰富的经验[12]。研究显示,花生根结线虫(酯酶表型A1)在中国非常罕见,其主要特征是酯酶为罕见的A1型,会阴花纹特征也非常明显,会阴花纹的线纹波浪状明显和侧线粗大等特征是其所特有的。同工酶特别是酯酶和苹果酸脱氢酶是根结线虫分类鉴定的一种重要手段,但是这一方法需要活力旺盛的雌虫[13]。本研究也证实了酯酶作为分类鉴定的重要辅助手段的实用性和准确性。我们采用酯酶成功地区分了以上几种根结线虫,它们所产生的谱带都有所不同,南方根结线虫的谱型为I2型,爪哇根结线虫的谱型为J3型,花生根结线虫的谱型为A2型和罕见的A1型,西班牙根结线虫的谱型为S2-M1型,象耳豆根结线虫的谱型为罕见的VS1-S1型。南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫(A1)和西班牙根结线虫的COⅡ和lrRNA基因间序列PCR扩增结果均为1.7 kb,所以单靠这种方法进行鉴定非常困难。因此,形态学、同工酶和分子生物学相结合的鉴定方法在根结线虫分类鉴定中已经得到国际上的公认[12]。

南药植物受根结线虫的危害非常严重,其中尤以海巴戟受害最重,以上5种根结线虫均能危害海巴戟,发病率高达90%以上,根结指数Ⅱ级以上。由于根结线虫病是一种隐蔽性强的植物病害,不易被及时发现,所以病害的发生往往使南药的产量和品质受到重大影响。因此,应当进一步广泛、深入地开展南药植物根结线虫病的研究,为南药育种和南药根结线虫病防治提供技术支持。

[1] 颜炳稳.漫话海南的南药[J].生物学教学,2001,26(9):39-41.

[2] 汪来发,杨宝君,李传道.华东地区根结线虫的调查[J].林业科学研究,2001,14(5):484-489.

[3] 杨宝君.十五种根结线虫病害的病原鉴定[J].植物病理学报,1984,14(2):107-111.

[4] 符美英,陈绵才,肖彤斌.海南海巴戟根结线虫病及综合防治[J].中国植保导刊,2009,29(2):32-33.

[5] 方中达.植病研究方法[M].北京:中国农业出版社,1998:308-309.

[6] 刘维志.植物线虫志[M].北京:中国农业出版社,2003:313-450.

[7] 胡凯基.酯酶在根结线虫分类上应用的研究[J].林业科学研究,1988(6):650-656.

[8] 万新龙,李建洪,彭德良.根结线虫rDNA-ITS片段的克隆与序列分析[J].华中农业大学学报,2007,26(5):624-628.

[9] 廖金铃.根结线虫的鉴定及其DNA多态性研究[D].广州:华南农业大学,2001.

[10]吴影梅,陆安娜.南药根结线虫病[J].中药材,1994,17(6):5-8.

[11]赵洪海.中国部分地区根结线虫的种类鉴定和四种最常见种的种内形态变异研究[D].沈阳:沈阳农业大学,1999.

[12]卓侃,胡茂秀,廖金玲,等.广东省和海南省象耳豆根结线虫的鉴定[J].华中农业大学学报,2008,27(2):193-197.

[13]刘昊,龙海,鄢小宁,等.海南省番石榴根结线虫病病原的种类鉴定及其寄主范围的测试[J].南京农业大学学报,2005,28(4):55-59.

(责任编辑：王 音)

Species identification of the root-knot nematode on southern herbs in Hainan Province

Fu Meiying, Zeng Xiangping, Rui Kai, Chen Miancai

(Institute of Environment & Plant Protection, Hainan Academy of Agricultural Sciences, Hainan Key Laboratory for Control of Plant Diseases and Insect Pests, Haikou 571100, China)

The root-knot nematodes collected from southern herbs of nine cities in Hainan Province were identified by using morphological characteristics, isoenzyme technology and mtDNA-PCR method.Meloidogyneincognita,M.javanica,M.arenaria,M.hispanicaandM.enterolobiiwere found on southern herbs. These identified five root knot nematodes could parasitize onMorindaofficinalisand cause serious economic loss, whileM.incognitawas the predominant species and could be found on most investigated herbs.

southern herbs; root-knot nematode; identification; mitochondrial DNA

2014-07-03

2014-09-09

海南省中药现代化专项(ZY201322)；海南省自然科学基金(312081)

S 435.67

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.04.033

* 通信作者 E-mail: chenmiancai@163.com