眩晕定颗粒对后循环缺血性眩晕家兔Bcl-2，Bax及BDNF表达的影响

肖 瑶，彭逢春，王净净*，刘春华，左亚杰，何 群，何英樱，袁斯思

（1.湖南省人民医院，湖南 长沙410005；2.湖南中医药高等专科学校附属第一医院，湖南 株洲412000；3.湖南中医药大学，湖南 长沙410208；4.湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙410006；5.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007； 6.湖南郴州市中医院，湖南 郴州423000）

眩晕是指感觉自身或环境的旋转、摆动，是一种运动幻觉，在以眩晕/头晕为主诉的患者中，存在后循环缺血(posterior circulation ischemia，PCI)的比例可达59.89%[1-2]。神经细胞凋亡是脑缺血损伤的重要病理机制。 Bcl-2、Bax 基因是目前研究较明确的一对在功能上相互对立的凋亡调控基因，其表达蛋白对神经元凋亡具有调控作用。 脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)能维持神经系统的正常发育，阻止脑细胞凋亡。 临床实践证明，“眩晕定方” 能有效改善眩晕患者的临床症状[3]。“眩晕定颗粒” 是将导师王净净教授多年临床经验总结的自拟方“眩晕定方”，经过水提，超临界二氧化碳(SFE-CO2)萃取丹参、当归、川芎等5 味中药材，制成的纯中药颗粒。 笔者以脑干前庭神经核相关因子作为观测指标，研究“眩晕定颗粒”对气虚血瘀型后循环缺血性眩晕家兔模型的影响，以期探讨该药的作用机制，为眩晕定方中药新药开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康成年新西兰白兔70 只 （由湖南中医药大学实验动物中心提供， 动物合格证号：SCXK（湘）2010-0011，雌雄各半，清洁级，体质量（2.0±0.3）kg，兔龄3～4个月，室温10～20 ℃，湿度65～70%，除正常组自由饮水进食外，其余家兔自由进水、控制进食+高脂饲料喂食。

1.1.2 高脂饲料 高脂饲料（每100 g 高脂饲料中含有胆固醇1 g，蛋黄粉15 g，猪油5 g 和普通饲料79 g）， 由湖南中医药大学实验动物中心提供和制作；胆固醇，购自长沙丽欣生物（CAS 号：57-88-5）；蛋黄粉， 亳州市众意蛋业有限责任公司 （批号：20100726）；猪油，自制。

1.1.3 受试药物 眩晕定颗粒：由黄芪、当归尾、党参、川芎、牡丹皮、地龙、葛根、丹参等11 味药组成，以上中药材均购自于安徽海鑫中药饮片有限公司，经过SFE-CO2提取、 水煎煮回流提取以及浓缩、纯化、干燥后得到颗粒制剂（由湖南中医药大学药学院与第一附属医院药剂科完成），每袋6 g（相当于生药材86 g）[4]；眩晕定方浓缩液：药物组成同颗粒制剂， 药材浸泡后， 水煎煮2 次， 每次煎得药液200 mL，合并药液，浓缩至125 mL，每毫升含生药1 g；西比灵胶囊：5 mg/粒（西安杨森制药有限公司，批号：20100203）；眩晕宁片：0.38 g/片，（桂林三金生物药业有限责任公司，批号：20100504）。

1.1.4 主要药物 消痔灵注射液（吉林集安制药集团，批号：20100416）；利多卡因注射液（上海朝晖药业有限公司，批号：20100618）。 消痔灵注射液与利多卡因按1∶1 的比例混合配成造模用硬化剂注射液。

1.1.5 试剂及仪器 SABC 试剂盒（SA1022，Lot NO.06A10BJ）、BDNF 试剂盒 （BA4053）、Bcl-2 试剂盒（BA0412）、Bax 试剂盒（BA0315），均购自武汉博士德生物工程有限公司；LEICA DM LB2 型双目显微镜（德国LEICA 公司）；Shandon 325 型石蜡切片机（英国Shandon 公司）；自制“可调速眩晕产生仪”(由湖南航空航天机械加工厂制作)，在其直流调速电机前加一个调速器，使旋转速度0～150 r/min 自由可调，通过机械离心力诱发家兔产生眩晕症状，在电机上连一个圆形金属盒用来固定家兔，大小(直径×高)：35 cm×35 cm；自制“逃避刺激反射训练箱”(由湖南航空航天机械加工厂制作)， 大小为70 cm×65 cm×65 cm，底板为金属板，通电后可因导电而产生疼痛刺激， 在笼内安装1个25 cm 的高台， 其面积为6 cm×30 cm 大小，供家兔逃避疼痛刺激而设。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 参照血管性眩晕动物模型制作方法[5]，选取清洁级健康成年新西兰大白兔70 只，体质量（2.0±0.3）kg，雌雄各半。 随机抽取其中8 只作为正常组，予以普通饲料80 g/（kg·d），每天分2次喂给，不作任何干预；其余62 只采用饥饿+高脂饲料+旋转+颈椎旁注射硬化剂复合方法造模。 高脂干预， 即所有造模家兔予以高脂饲料10 g/(kg·d)喂养，时限为实验全过程；饥饿干预，即在高脂饲料喂养之外，仅给予普通饲料15 g/(kg·d)同时一次投予，时限同高脂饲料；硬化剂注射，先予以颈椎旁注射硬化剂(记为实验开始第1 天)，1 周后重复1 次，以后隔周重复1 次，6 周注射结束，共注射4 次；在第4 次硬化剂注射之前，即实验第39～41 天，使用逃避刺激反射训练箱对正常组及造模家兔进行逃避刺激反射训练，以胡萝卜进行奖励以建立稳固的条件反射；实验第42 天，在第4 次硬化剂注射完毕后，使用可调速眩晕产生仪进行旋转刺激，用逃避刺激反射训练箱中的跳台装置测定旋转刺激前后的跳台耗时，对比记录；实验第43 天，对所有家兔行指标检测，得出结果后通过综合评分，将符合后循环缺血性眩晕模型的家兔选出，视为造模成功。

1.2.2 模型评定 自拟后循环缺血性眩晕家兔模型评分量表，给造模家兔进行评分，选出满足评定标准的家兔，视为造模成功。 （1）旋转后家兔出现眼震；（2）脑干听觉诱发电位显示出现I～V 波型分化差、重复性不良或PL 延长，和/或IPL 延长；（3）脑血流图显示椎-基底动脉系统供血较造模前减少20%或以上；（4） 旋转后跳台耗时较旋转前延长6 s 或以上。其中必须满足第1 条，再加上（2）-（4）中任意1 条者均判定为成功模型。

1.2.3 动物分组及给药方法 将造模成功的家兔选出，按体质量由小到大编号，采用完全随机设计方法再分为模型组、西药对照组、中药对照组、眩晕定汤剂组、眩晕定颗粒组，共5 组。 模型组以10 mL双蒸水灌胃； 西药对照组予以西比灵0.5 mg/(kg·d)溶于10 mL 双蒸水中灌胃； 中药对照组以眩晕宁0.165 g／(kg·d)溶于10 mL 双蒸水中灌胃；眩晕定汤剂组以眩晕定方浓缩液10 mL/(kg·d)灌胃；眩晕定颗粒组以0.5 g/(kg·d) 溶于10 mL 双蒸水中灌胃。给药时间为7 d。 灌胃结束后对所有家兔进行标本取材及检测。

1.2.4 免疫组织化学方法检测相关因子的表达 实验结束后，空气栓塞法处死家兔后，冰盆上迅速取出完整脑组织，置入40 g/L 多聚甲醛液中于4 ℃下固定24 h，截取脑干部分（含较完整的前庭神经核），常规脱水， 石蜡包埋后行冠状位切片， 片厚4～5 μm。 切片常规脱蜡至水，经30% H2O2甲醇处理，室温10 min 灭活内源性过氧化物酶， 微波热修复抗原，滴加5% BSA 封闭液，室温20 min；滴加适当稀释的一抗（工作浓度约为1∶200），湿盒内4 ℃孵育过夜，充分漂洗，加入相应生物素化二抗，37 ℃孵育， 漂洗后滴加试剂SABC，37 ℃孵育，PBS 洗涤，，DAB 显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。 用显微镜（德国Leica 公司）和Mias2000 图像分析系统采集图像。 每张切片随机选取5个相邻视野，以切片背景的灰度值作背底校正，对每张切片前庭神经核区Bcl-2、Bax 及BDNF 免疫反应产物进行光密度测定。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 动物存亡情况

按照造模方法“1.2.1”，截止至第6 周，死亡13只，死亡率21%，造模家兔达到眩晕模型标准的共46 只，造模成功率74.2%。 造模致死的原因考虑注射位置及深度把握不当，误使利多卡因注入延髓导致呼吸麻痹而死。 将造模成功的家兔随机分为模型组、西比灵组、眩晕宁组、眩晕定汤剂组和颗粒组，共5 组，每组8 只。 各组分别灌胃7 d 后，模型组死亡2 只， 眩晕宁组及眩晕定颗粒组各死亡1 只，西比灵组及眩晕定汤剂组无死亡。 灌胃致死原因考虑灌胃操作不当或手法不熟练误使药液灌入肺中导致肺栓塞而死。

2.2 各组Bcl-2 表达的比较

光镜下， 各组家兔前庭神经核区Bcl-2 阳性神经元染色均以胞浆有棕黄色物质沉积为主， 也有部分胞膜及核膜着色，并可显示神经元轮廓。 正常组可见大量棕色颗粒，均匀分布，Bcl-2 表达较为明显，而模型组仅有少量棕色颗粒，偶有Bcl-2 表达。 西比灵组、眩晕定汤剂组和颗粒组可见较多的棕色颗粒，各组数量相当，Bcl-2 的表达接近正常组， 较眩晕宁组明显。统计结果显示，模型组家兔前庭神经核区Bcl-2 表达较正常组显著降低（P＜0.001），而经过药物干预后的各组家兔Bcl-2 表达较模型组增强 （P＜0.05或P＜0.01），其中以眩晕定汤剂组、眩晕定颗粒组以及西比灵组较为明显（P＜0.01 或P＜0.001），其三组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。说明眩晕定汤剂及颗粒剂均有上调Bcl-2 基因表达的作用，其疗效与西比灵相当。 见表1，图1。

表1 眩晕定颗粒对眩晕模型家兔前庭相关因子表达情况的影响（±s）

表1 眩晕定颗粒对眩晕模型家兔前庭相关因子表达情况的影响（±s）

注：与正常组比较▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，▲▲▲P＜0.001；与模型组比较#P＜0.05，##P＜0.01；###P＜0.001；与眩晕宁组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

组 别正常组模型组西比灵组眩晕宁组眩晕定汤剂组眩晕定颗粒组F 值P 值n 8687 8 7 Bcl-2 平均光密度0.31±0.05 0.16±0.02▲▲▲0.25±0.08##0.22±0.05▲▲#0.28±0.07###*0.29±0.06###*5.381＜0.001 Bax 平均光密度0.26±0.05 0.38±0.07▲▲▲0.30±0.04##0.34±0.09▲▲0.26±0.04###**0.27±0.04###*5.543＜0.001 BDNF 平均光密度0.38±0.04 0.22±0.05▲▲▲0.34±0.04###0.30±0.07▲##0.36±0.08###0.38±0.05###*6.294＜0.001

2.3 各组Bax 表达的比较

光镜下，各组家兔前庭神经核区Bax 阳性神经元染色均以胞浆有棕黄色物质沉积为主，也有部分胞膜及核膜着色，并可显示神经元轮廓。 正常组偶见棕色颗粒，Bax 的表达不明显；而模型组有大量棕色颗粒，分布密集，Bax 的表达显著。 眩晕定汤剂组及颗粒组可见散在棕色颗粒，其数量少于西比灵组及眩晕宁组。 统计结果显示，模型组家兔前庭神经核区Bax 表达显著高于正常组（P＜0.001），而经过药物干预后各组家兔Bax 表达较模型组降低，其中以眩晕定汤剂组、眩晕定颗粒组较为明显（P＜0.001），其两组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。 说明眩晕定汤剂及颗粒均能下调促凋亡基因Bax 表达，且其疗效相当。 见表1，图1。

2.4 各组BDNF 表达的比较

在光镜下可见BDNF 免疫组化反应棕黄色阳性物质多存在于神经细胞胞浆、神经突起中，部分胶质细胞也呈阳性，但核不着色，有时可见阳性反应物环细胞表面分布。 正常组可见大量棕色颗粒，均匀分布，BDNF 表达较为明显，而模型组仅有少量棕色颗粒，偶有BDNF 表达。 西比灵组、眩晕定汤剂组和颗粒组可见较多的棕色颗粒， 各组数量相当，BDNF 的表达接近正常组， 眩晕宁组可见少量棕色颗粒，BDNF 的表达不明显。 统计结果显示，模型组家兔前庭神经核区BDNF 表达较正常组显著降低（P＜0.001），而经过药物干预后的各组家兔BDNF 表达较模型组都有所增加（P＜0.01），其中以眩晕定汤剂组、 眩晕定颗粒组以及西比灵组较为明显 （P＜0.001）， 其三组之间比较差异无统计学意义 （P>0.05）。 见表1，图1。

图1 各组Bcl-2、Bax、BDNF 的表达光镜图（×400）

3 讨论

后循环缺血是由椎基底动脉系统缺血引起的病变，是常见的缺血性脑血管疾病，约占所有缺血性脑血管病的20%[6]。 后循环血管走行及分支生理变异大，约60%供应脑干的血管较细，很容易受到血流动力学和血管腔变化的影响。 前庭核团在脑干的分布广，使其对缺血极其敏感。 因此，后循环缺血患者常有眩晕。 后循环缺血的发病机制包括大动脉狭窄和闭塞引起低灌注、血栓形成及动脉源性栓塞等，主要病理特征是动脉粥样硬化及在其基础上形成的血管狭窄[7]。 后循环缺血性眩晕属中医“眩晕”范畴。 历来医家们认为此病病因病机为本虚标实，以虚为主，主要夹风、火、痰、瘀等。 而目前认为“气虚血瘀”是最主要的病因病机，也是现代人最普遍的体质特性[8]，这也意味着现代人更易因“虚、瘀”致晕。

根据后循环缺血的病理改变特点和中医眩晕的病因病机，本实验采用饥饿+高脂饲料+颈椎旁注射硬化剂+旋转的复合方法造模， 力求造成与临床相符的病症结合的后循环缺血性眩晕动物模型。 中医认为高脂血症和动脉粥样硬化属于本虚标实，本虚指脏腑虚损元气不足， 标实指痰浊瘀血交阻内留。 若脾失健运，水谷不化，则酿生痰浊，积聚体内，故有“脾为气血生化之源”、“脾为生痰之源”之说，故我们选择“饥饿+高脂饲养”为干扰因素贯穿于整个造模过程。 本实验前期研究亦证实[9]，高脂饲养能使家兔血液粘稠度增加，降低其脑血流量。 硬化剂注射后， 注射侧颈部肌肉会出现颈椎偏斜甚至扭曲。 组织病理学显示，颈椎侧面肌肉和颈动脉管壁组织早期有变性、坏死，后期肌肉纤维化挛缩、动脉管壁纤维化粘连和管腔缩窄等。 提示该方法能使颈部肌肉纤维、挛缩，并可能破坏颈椎力学平衡机制，使颈动脉受到牵张减少其血流，从而导致后循环缺血[10]。

大脑对缺血缺氧十分敏感，脑缺血后继发的病理生理改变对脑细胞造成的损伤是脑缺血损伤的重要原因之一。 一般认为坏死与凋亡是受损脑细胞死亡的两大主要机制，当损伤达到一定程度时引起细胞坏死，而低程度的损伤则导致细胞凋亡[11]。 Bcl-2 蛋白家族主要分布于线粒体、 内质网和胞核的外膜，是一组细胞凋亡调控蛋白。 Bcl-2 作为目前首个被确认有抑制细胞凋亡作用的因子，成为脑缺血再灌注损伤的研究热点之一，其家族成员之间的相互作用对脑缺血后神经细胞的凋亡起了重要的调节作用。 其中Bcl-2 和Bax 作为Bcl-2 家族蛋白的最主要成员，其表达的变化对细胞凋亡起重要的调节作用，两者的比值决定了细胞是否凋亡：当Bcl-2 表达占优时抑制细胞凋亡，Bax 表达占优时则促进细胞凋亡[12-13]。 BDNF 是在脑内合成的一种蛋白质，它广泛分布于中枢神经系统，对神经元的生存、分化、生长和维持神经元正常的生理功能起关键作用。BDNF 的表达增加，可延缓神经元的坏死和凋亡，并刺激神经血管的生成，最终实现神经生理功能的重建[14]。本实验结果显示，模型组家兔与正常组及其他药物治疗组比较， 脑干前庭神经核Bcl-2 及BDNF表达下降，Bax 表达上调，提示此复合造模法能使促进细胞凋亡因素增加，神经保护因素减弱。 考虑其原因可能是长期高脂饮食喂养，导致家兔动脉粥样硬化，加之颈椎旁硬化剂注射使椎基底动脉狭窄及局部血管炎症侵润，造成后循环缺血，继而脑细胞损伤所致。

“眩晕定方”是导师王净净教授在总结中医诸家对眩晕病因病机论述的基础上，以“补阳还五汤”作为基础方，依据《景岳全书·眩晕》“无虚不作眩”，及明·虞抟提出的“血瘀致眩”的理论，在多年临床经验中总结的经验方，具有益气升清、活血化瘀之功效。 方以黄芪、当归尾、川芎、牡丹皮、丹参、地龙、防风、葛根等11 味药组成。 其中黄芪为君药，能大补脾胃之气，使气旺而血行，祛瘀而不伤正；有研究发现[15]，黄芪多糖可通过下调Bax 蛋白的表达对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤产生保护作用。 川芎辛温香窜，为血中之气药；药理研究表明[16]，川芎嗪可通过上调缺氧缺血大鼠脑组织中的Bcl-2 蛋白表达，下调Bax 蛋白表达，从而抑制神经细胞凋亡，减轻缺氧缺血所致的脑组织损伤。 丹参具有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈的功效；试验研究证实[17]，丹参可抑制动脉粥样硬化斑块的形成， 而调节Bcl-2/Bax 表达及炎症机制参与可能是其抗动脉粥样硬化的机制之一；又有研究表明[18]，丹参多酚酸盐能明显提升脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中BDNF 及GDNF 的含量，且随着药物剂量的增加，其提升作用越发明显。本研究亦证实，经药物干预后，眩晕定颗粒可以促进脑干前庭神经核内的Bcl-2、BDNF表达上调， 推测眩晕定颗粒可能通过逆转粥样硬化，消除局部炎症反应，从而改善脑干前庭系统的供血障碍，使脑神经元细胞得到保护。 前期临床研究已经证实，眩晕定汤剂能明显改善气虚血瘀型眩晕患者的中医证候，其疗效确切[3]。 动物实验研究亦表明[19-20]，眩晕定方能改善椎基底动脉供血不足型眩晕家兔模型大脑的循环血流量， 降低血脂，改善血流变学指标，且安全有效，无明显毒副作用。 本实验结果还证实，眩晕定颗粒与眩晕定汤剂疗效相当，既保持了汤剂吸收快、作用迅速的特点，又克服了汤剂使用时煎煮不便、服药量大、易霉变等缺点，发展前景良好，值得在临床上进行推广。

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