石榴皮多酚对痤疮丙酸杆菌体外抑菌活性的研究

张晓玲，朱明芳*，杨 柳，胡 彬，谢 遥

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙410208；2.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙410005）

痤疮是一种多种因素引起的常见的毛囊、皮脂腺慢性炎症性疾病，目前研究认为，痤疮的发病机制主要与雄激素、皮脂分泌增多、毛囊口上皮角化亢进、痤疮丙酸杆菌增殖及遗传等因素有关[1]。 而痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acne, P. acnes）在痤疮的发病中扮演着重要的角色，是痤疮发病的重要病原菌之一，也是外用药物治疗痤疮的重要靶点[2]。因而，寻找抑制P.acnes 生长的药物，成为治疗痤疮的一个重要研究方向。 目前主要的外用药物包括抗生素和维生素A 酸类，前者存在易产生抗生素耐药等严重问题，后者则有刺激性和潜在的致畸危险等不足，因此探索安全性好、不易耐药的外用抗痤疮药物较为迫切[3]。

石榴皮为石榴科植物石榴的干燥果皮。 其性酸、温、涩，具有涩肠、止血、收敛止泻以及杀虫等功效[4]。 石榴皮的主要生物活性成分为石榴皮多酚，主要包括鞣花单宁、没食子单宁、鞣花酸和没食子酸等多种化合物, 具有抗菌、抗氧化、抗衰老、抗突变、降血压和润肤美容之功效[5]，而在临床实践中，也证实石榴皮对霍乱弧菌、痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏杆菌、溶血性链球菌、伤寒杆菌、绿脓杆菌、结核杆菌及多种皮肤真菌都有抑制作用[6-7]。

石榴皮多酚对痤疮的作用研究目前尚未见报道，我们将通过观察石榴皮多酚在体外P. acnes 是否存在抑制作用，为开发新型外用痤疮治疗药物奠定实验基础。

1 材料

1.1 药材与试剂

石榴皮多酚醇提物（购自陕西慧科科技公司，石榴皮多酚含量为70%)；甲硝唑纯品(购于长沙丽欣有限公司，纯度为99.9%) 。

1.2 菌株

P. acnes 标准菌株ATCC11827 （广东微生物菌种保藏中心提供）。

1.3 主要实验仪器

PL202-S 精密电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；LDZX-30KB 立式电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；GNP-9270 型隔水式恒温培养箱（上海三发科学仪器有限公司）；麦氏比浊管（北京哲成科技有限公司）。

2 方法

2.1 培养基的制备

培养基按庖肉培养基说明进行常规配制，调pH值为7.1～7.2， 将配制好的培养基于锥形瓶中密封好后，放入灭菌锅中于121 ℃下灭菌30 min，待冷却后，置于4 ℃冰箱中保存备用。

2.2 菌悬液的制备

标准菌株活化后接种于平板培养基上进行增菌培养（用厌氧袋封装，37 ℃下恒温培养72 h）后用无菌生理盐水冲洗，将菌悬液用无菌生理盐水稀释后，调整为0.5个麦氏比浊单位（约为1.5×108CFU/mL），备用。

2.3 药物溶液制备

2.3.1 受试药石榴皮多酚溶液配制 取石榴皮多酚醇提物，用灭菌后的无菌蒸馏水首先从1:1 开始让粉末溶解， 配置成500、300、100 mg/mL 3 种浓度的溶液，备用。

2.3.2 对照药品溶液的制备 按NCCLS 公布的对厌氧菌判断敏感标准[8]，精确称取甲硝唑1.0 mg，用DMSO 溶解，最终配制为16 μg/mL 的溶液。

2.4 抑菌活性测定

2.4.1 生长抑制试验——牛津杯法 制备固体培养基，待预热培养基温度降至45 ℃时，于每个平板加入20 mL，在无菌操作条件下，吸取上述菌悬液（约为1.5×108CFU/mL）100 μL，用涂布棒均匀涂抹在冷却凝固的培养基上。再用无菌镊将牛津杯轻放在培养基表面，轻压牛津杯使接触良好。 分别取3个不同浓度的石榴皮多酚水溶液200 μL 加入牛津杯中， 于37 ℃恒温培养箱中厌氧培养72 h 后取出，用游标卡尺准确测量各培养皿中供试液有效抑菌圈的直径(mm)，计算平均值。各浓度重复4 次，另外配置对照组：空白对照组（培养基）、阳性对照组（菌悬液、培养基、甲硝唑），观察细菌的生长情况、培养基和石榴皮多酚对细菌生长的影响。 抑菌效果判断标准：抑菌圈直径＜6 mm 为耐药；抑菌圈直径在6～10 mm 为轻度敏感； 抑菌圈直径在10～14 mm 为中度敏感；抑菌圈直径在15～20 mm 为高度敏感；抑菌圈直径＞20 mm 为极度敏感[9]。

2.4.2 最小抑菌浓度(MIC)测定——药基琼脂稀释法 用无菌移液枪分别吸取1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05 mL 500 mg/mL 的石榴皮多酚水溶液，分别注入到10 mL 无菌试管中，再依次加入4、4.2、4.4、4.6、4.8、4.9、4.95 mL 无菌培养基（温度＜45 ℃），充分混匀后冷却制成含药液固体斜面，即最终药液浓度分别 为100、80、60、40、20、10、5 mg/mL；吸取菌悬液（1.5×108CFU/v） 0.1 mL 由上而下流满斜面，并以培养基和纯药液管作阳性和阴性对照。 于37 ℃恒温厌氧培养72 h 后，观察P. acnes 的生长情况。以上步骤重复3 次，从各管中找出完全没有菌生长的最低稀释液浓度的实验管，作为MIC。

2.5 统计学分析

所有数据使用SPSS 19.0 软件进行处理，计数资料用“±s”表示，各小组组间差异显著性判断采用方差分析，组间比较采用LSD 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 牛津杯法的抑菌结果

生长抑制实验牛津杯结果提示，石榴皮多酚醇提物和阳性对照药对P. acnes 均有抗菌活性，且抑菌圈直径都大于l0 mm， 敏感性较强， 其中500 mg/mL 的抑菌圈的直径大于20 mm， 为极度敏 感，300、100 mg/mL 的 抑 菌 圈 的 直 径 在15 ～20 mm，为高度敏感，阳性对照药甲硝唑的抑菌圈直径在10～14 mm，为中度敏感。 阳性对照组与空白对照组比较有统计学意义（P＜0.05），而3 种浓度的石榴皮多酚醇提物与空白对照组比较，差异显著（P＜0.01）， 与阳性对照组比较无统计学意义 （P＞0.05）。 由抑菌圈的直径比较可知，石榴皮多酚醇提物对P. acnes 的抑菌作用较强， 有一定的临床意义，而作为阳性对照的甲硝唑，其抑菌作用较预期弱，值得进一步研究。 结果见表1、图1、图2。

表1 不同浓度石榴皮多酚醇提物对P. acnes 体外抑菌实验结果 （±s，mm,n=4）

表1 不同浓度石榴皮多酚醇提物对P. acnes 体外抑菌实验结果 （±s，mm,n=4）

注：△代表石榴皮多酚醇提物；与空白组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

药物500 mg/mL△300 mg/mL△100 mg/mL△甲硝唑空白组抑菌圈直径25.90±1.28**20.70±1.05**17.78±1.12**12.50±0.93*0

3.2 药基琼脂稀释法的抑菌结果测定

从图3、 图4 中可看出P. acnes 只在阳性和10 mg/mL、5 mg/mL 加药试管中长出菌落,余试管中都未长有P. acnes 菌落，可知其MIC 为20 mg/mL。见表2。

表2 石榴皮多酚醇提物对P. acnes 的MIC（mg/mL，n=3）

图1 牛津杯法（培养前）

图2 牛津杯法（37 ℃厌氧培养72 h 后）

图3 药基琼脂稀释法（培养前）

图4 药基琼脂稀释法（37 ℃厌氧培养72 h 后）

从左到右的顺序，试管中石榴皮多酚醇提物的浓度依次为100、80、60、40、20、10、5 mg/mL。

4 讨论

目前痤疮的治疗主要从心理、药物和物理治疗三方面出发，而抑制痤疮发病相关菌——痤疮丙酸杆菌的生长增殖则是从源头开始的治疗手段。 本实验采用了牛津杯法，因该方法具有易操作、低成本的特点，实验结果也易于判读和比较。 在平板中，越靠近牛津杯，药物浓度越大，反之则越小，直到药物的浓度无法抑制其菌种生长时才长出菌落，形成以牛津杯为中心的抑菌圈，但是此方法无法测出药物的MIC。 近几年来， 我国最常用的体外药物敏感试验测量药物对菌种MIC 的方法是美国临床实验室标准研究所制定的方案，但其方案是根据药物对菌种生长抑制的混浊度或是运用比色法进行MIC 终点判读的。而中药的MIC 终点判读困难是因提取物本身具有一定的颜色所造成。 因此，通过比较，最后本实验采用具有简便经济且易于操作的药基琼脂稀释的方法测量MIC，这种方法准确直观，结果判读精确，易于比较。

本实验结果表明，石榴皮多酚醇提物在体外具有明确的抑制痤疮丙酸杆菌活性的作用。 但本次实验仅进行了石榴皮多酚醇提物体外敏感试验的研究，尚缺乏临床验证，其作用机理与临床应用效果的进一步研究暂时缺乏，而药物在人体皮肤上的作用机制比体外敏感试验相对复杂，临床上石榴皮多酚作用于人体皮肤时能否达到与体外相同的效果，还有待进一步观察与验证。 因此，在体外抑菌实验的基础上，我们需要进一步开展动物实验，如此才能筛选出真正安全有效的中药。

[1]李贤俏,杨金生. 痤疮的病因病机和外治法研究进展[J].中国中医基础医学杂志,2013,19(6):713-716.

[2]Kircik LH. Re-evaluating treatment targets in acne vulgaris：adapting to a new understanding of pathophysiology [J]. J Drugs Dermatol，2014，13(6)：S57-S60.

[3]Coates P，Vyakrnam S，Eady EA，et al. Prevalence of antibiotic-resistant propionibacteria on the skin of acne patients：10-year surveillance data and snapshot distribution study [J]. Br J Dermatol，2002，146(5)：840-848.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典2015年版[S].北京：中国医药科技出版社，2015：93.

[5]Sreekumar S, Sithul H, Muraleedharan P, et al. Pomegranate fruit as a rich source of biologically active compounds. Biomed Res Int, 2014，（2014）：1-12.

[6]杨筱静， 赵波， 那可， 等. 石榴皮中多酚类物的的研究进展，2013，44（5）：509-514.

[7]何宇.石榴皮提取物抑菌活性研究进展[J].安徽农业科学，2012，40(35)：17 306-17 307，17 372.

[8]胡继红，高振祥，尹铭芳.简介美国临床实验室标准化委员会最新推荐厌氧菌药敏实难方法及评价[J].中华检验医学杂志，2002，25（3）：183-184.

[9]戴自英.临床抗菌药物学[M].北京：人民卫生出版社，1985：219-223.