杂交水稻种子纯度鉴定方法对比研究

曹栋栋，詹 艳，王 洋，阮晓丽，徐小优

(1.浙江农科种业有限公司,浙江杭州 310021;2.浙江省农业科学院作物与核利用研究所,浙江杭州 310021; 3.浙江农林大学农业与食品科学学院,浙江杭州 311300)

杂交水稻种子纯度鉴定方法对比研究

曹栋栋1，2，詹 艳1，王 洋3，阮晓丽1，徐小优1

(1.浙江农科种业有限公司,浙江杭州 310021;2.浙江省农业科学院作物与核利用研究所,浙江杭州 310021; 3.浙江农林大学农业与食品科学学院,浙江杭州 311300)

种子纯度是水稻种子质量的核心指标,准确鉴定种子纯度对种子质量标准化、品种审定、假种辨别、产权纠纷等具有重要作用。本文概述并分析了杂交水稻种子纯度鉴定的几种常用方法及其优缺点,并对目前应用最广泛的田间种植鉴定和SSR分子标记鉴定方法进行了比较分析,认为SSR分子标记技术适用于大规模、快速、准确鉴定杂交水稻种子纯度。

杂交水稻;种子纯度;田间鉴定;SSR分子标记

文献著录格式:曹栋栋,詹艳,王洋,等.杂交水稻种子纯度鉴定方法对比研究[J].浙江农业科学,2015,56(5):718-722.

DOI 10.16178/j.issn.0528-9017.20150553

种子是农业生产中最基本的生产资料。种子质量是种子潜力的综合表现,它决定了种子萌发的潜力、出苗的一致性和幼苗正常发育的能力[1]。种子质量的高低直接影响农作物产量和农产品品质。种子质量包括品种质量和播种质量2方面,品种质量可以用“真”和“纯”表示,即品种的真实性和纯度;播种质量可以用“净、壮、饱、健、干、强”6个字概括,包括种子净度、发芽力、生活力、活力、健康状况、水分和重量[2]。种子质量是种业经营的核心。种子质量比一般商品质量影响更长久、更深远、更广泛[3]。种子质量检验是保证种子质量的关键。目前我国种子质量检验内容包括种子纯度、净度、水分和发芽率4项指标。种子纯度是种子质量的核心指标,准确鉴定种子纯度对种子质量标准化、品种审定、假种辨别、产权纠纷起着重要作用。它是保证良种优良遗传性状充分得到发挥的前提,是促进农业生产持续稳产、高产的有效措施,也是防止良种混杂退化,提高种子质量和产品品质的必要手段[4]。此外,种子纯度也是种子企业生存的根本,是企业种子加工、销售决策的关键依据[5]。目前,种子纯度检测方法主要可分为田间小区种植鉴定和室内检验。其中,室内检验法主要包括种子形态鉴定、幼苗鉴定、蛋白质指纹鉴定和DNA分子标记鉴定等。本文将以水稻为例,对种子纯度检测的室内检验和田间鉴定方法进行比较分析,并对其应用前景进行探讨。

1 室内检验方法简述

1.1 蛋白质指纹鉴定

种子中的蛋白质组分是基因表达的产物,记录了物种在发育过程中的亲缘关系,以及种间与品种间的遗传差异[6],通过电泳技术得到多态性的蛋白质指纹图谱,可用于鉴别不同品种的真实性和纯度,即蛋白质指纹鉴定技术。蛋白质指纹鉴定技术包括同工酶电泳和蛋白质电泳。吴建梅等[7]采用酯酶同工酶电泳法,对10份特优系列组合进行了纯度鉴定,发现其结果与田间种植鉴定结果存在较好的一致性。然而,由于同工酶的表达在时间和空间上存在特异性,影响了同工酶在不同组织或器官中的分布和活性,同时环境因素对基因表达的影响也会使同工酶发生改变[8],因此同工酶电泳技术在杂交水稻组合种子纯度的鉴定上仍存在一定的局限性[9]。

蛋白质电泳法是根据蛋白质结构的差异来揭示基因的差异,由于直接测定的是蛋白质,因此具有快速、准确性高、重复性好的优点。目前用于检测的种子蛋白质主要是种子的贮藏蛋白质,如醇溶蛋白、清蛋白、球蛋白和谷蛋白等[10]。张凤等[11]采用蛋白质电泳技术检测了4个三系杂交稻组合和7个杂交稻F1代种子的纯度,结果表明盐溶蛋白多态性丰富,差异明显,蛋白质特征带稳定,且鉴定结果与田间小区种植鉴定结果基本吻合。此外,利用SDS-PAGE蛋白质电泳方法鉴定作物真实性和纯度,已在辣椒[12]、水稻[13]、啤酒大麦[14]和菜豆[15]中获得成功。但由于蛋白质是基因表达的产物,不能完全显示品种间的多态性,且受种子发育阶段及表达器官的影响,有时不够稳定,因而这种方法在种子纯度鉴定上的应用仍较少。

1.2 DNA分子标记鉴定

DNA分子标记技术直接分析遗传物质的多态性,通过比较不同品种基因组DNA的结构与组成,从鉴定品种DNA水平上的差异来鉴别品种的真实性和纯度[16]。该技术的本质是反映生物个体或种群间基因组种子某种差异的特异性DNA片段[17],因而具有不受外界环境因素影响、不受空间和时间限制、便于实现自动化等优势[18]。常用的分子标记可分为4类[19]:一是限制性酶结合使用分子杂交技术的标记,如RFLP标记;二是经PCR扩增的标记,如RAPD标记和SSR标记;三是限制性酶结合使用PCR扩增的标记,如AFLP标记,四是基于单核苷酸多态性的分子标记,如SNP。与RFLP和AFLP技术相比,SSR技术是基于PCR基础上的标记,操作相对简单,且其稳定性和重复性优于RAPD标记。SNP标记由于检测仪器和费用昂贵,技术相对不成熟。因此目前在杂交水稻种子纯度和真实性鉴定中最具有应用潜力的是SSR标记。

SSR(Simple Sequence Repeats,简单重复序列)是指基因组中由1～6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA,广泛分布于基因组的不同位置,长度一般在200 bp以下,相同座位上的重复序列由于重复次数不同而产生了等位基因的多态性。根据同一类SSR两端序列的相对保守性,设计特异引物,通过PCR扩增、电泳便可揭示不同个体在某个SSR位点上的多态性[20]。

彭锁堂等[21]利用SSR技术分析了9个杂交稻组合及其亲本,能有效区分所有恢复系和大部分不育系;对杂交稻组合汕优63和两优培九进行单粒种子SSR鉴定,所测纯度与田间种植鉴定纯度非常接近;这些结果表明SSR标记适合于杂交水稻种子纯度鉴定。刘之熙等[22]利用多态性好的2对SSR标记引物分别对参试的威优46和金优207进行纯度鉴定,能有效区分掺假的种子与真种子;且在该研究中使用的优化的SSR分子标记体系,缩短了检测时间,有助推进该技术在杂交水稻种子纯度鉴定中的应用。2007年,全国农技推广中心颁布GB/T 20396—2006三系杂交水稻及亲本真实性和品种纯度鉴定DNA分析方法,及NY/T 1433—2007水稻品种鉴定DNA指纹方法。2013年,利用已研制的水稻DNA指纹图谱鉴定技术标准,我国完成了900份已知水稻品种的DNA指纹图谱数据采集,为水稻新品种测试和已知品种数据库建设提供了技术与基础数据支撑,同时也为杂交水稻品种鉴定提供了依据。

除了上述DNA分子标记的优点外,SSR标记的优势还体现在其标记数量多,提供的信息量大,鉴定结果准确等方面。尤其是水稻基因组测序的完成,使得引物序列愈加丰富,也推进了该方法在品种纯度和真实性鉴定中的应用。其次,SSR标记具有共显性,一个标记往往具有多个等位基因,可在不同品系间获得多态性标记位点,特别适用于杂交种的纯度鉴定[23]。再次,SSR分子标记鉴定程序简单,所需时间短;且鉴定费用低,一般分子检测室均有能力开展。特别是国产分子检测仪器设备和药品耗材的开发,很大程度上降低了样品检测的费用。因此,该项技术特别适合于种子室内检验设施不太完善的中小型种子企业或科研院所。

在杂交水稻种子纯度鉴定过程中,一般将田间种植的混杂类型分为亲本(不育系和恢复系)、串粉混杂和其他类型(变异株和混杂的常规品种等)[24]。SSR标记可准确区分不育系和恢复系,对于混入的常规品种也易区分,但对于串粉混杂和变异株则较难区分。如郭承亮等[25]利用SSR标记RM21对两优287正季田间小区鉴定调查出的10种杂株类型的特异性进行验证,发现SSR标记只能区分其中6种杂株类型。针对这些问题,李进波等[26]认为可针对某一杂交稻组合,在田间收集此杂交稻的串粉混杂植株类型,从获得的多态性标记中进一步筛选出特异标记,以提高分子鉴定的准确性。郭承亮[5]利用筛选的多对SSR分子标记对杂交水稻种子纯度鉴定中的杂株类型进行定量鉴定,可确定种子所含的杂株类型及其各自所占比例,为种子企业提供了更准确、更全面的质量信息和可操作性强的加工处理方法。

1.3 其他室内鉴定方法

除了上述室内鉴定方法外,还有种子形态鉴定法、幼苗鉴定法和近红外光谱法等。利用种子的特异性形态特征区分不同的品种是品种鉴定中最基本、最简单的方法。在杂交水稻种子形态鉴定中,主要是依据种子形状、大小、颜色、茸毛长短稀疏、米粒色泽等,逐粒观察。但该方法对于鉴定亲缘关系近的品种有难度。幼苗鉴定法是让种子在温室中培养到一定阶段后,对幼苗进行鉴定;或让植株在特殊逆境条件下生长,通过检测抗性的不同进行区分[11]。但与种子形态鉴定类似,该方法也很难区分遗传背景相近的品种。近红外光谱检测是一项无损、快速的检测技术,Attaviroj等[27]利用该技术检测了5种潮湿稻谷的纯度,其准确度高达97%～100%,该技术可作为一种常规种子纯度检测技术。但由于近红外光谱需要针对不同品种建立相关的模型进行分析,操作难度较大,不适用于大规模种子纯度鉴定。

2 田间鉴定

田间鉴定是传统的种子纯度鉴定方法,即从种子批中选取一些具有代表性的样品播种到田间,其鉴定时期包括从种子发芽成苗到种子收获的整个过程。一般在苗期、分蘖盛期、抽穗扬花期和成熟期分4次进行鉴定,每次鉴定时记载鉴定样品与对照标准样品的差异,对变异株、异型株等杂株挂牌做好标记,在成熟期进行最后一次鉴定时汇总[28]。鉴定主要从4个方面入手:(1)植株性状的比较,如株高、茎秆粗壮程度、分蘖力、茎色、节间长度、茎节色、苗期的芽鞘色等;(2)叶片性状的比较,如叶片宽窄、叶片长短、叶色深浅、茸毛多少、叶片形态、剑叶角度、卡颈程度等;(3)穗部性状的比较,如穗形、穗子长短、着粒密度、芒的长度或有无等;(4)谷粒形状比较,如谷粒长度、千粒重大小、颜色、稃尖颜色、米粒色泽、米粒形状等。

田间小区种植鉴定是目前公认的杂交水稻种子纯度鉴定中比较可靠、准确的鉴定方法,也是国家标准规定的、目前鉴定杂交水稻种子纯度应用最广泛的方法[29]。目前,田间鉴定方法主要包括海南种植鉴定和正季种植鉴定。海南种植鉴定具有鉴定相对准确,时间相对提前的优点,但海南冬季属于短日低温条件,感光类型及两系不育系均表现为正常结实,对杂交稻尤其是两系杂交稻种子纯度的鉴定结果往往失真;正季种植鉴定具有鉴定准确、鉴定结果与大田生产实际吻合度高的优点,但时间明显滞后[5]。此外,田间种植鉴定所需周期长,费工占地,且需要鉴定人员具有专业知识和丰富的工作经验,因而不太适应当前水稻种子生产的需要。

3 田间鉴定与SSR分子标记检验结果比较

目前,种子企业常用的水稻种子纯度鉴定方法主要是田间种植鉴定和SSR分子标记鉴定。以5个水稻品种为材料,分别在上海、江西、海南、广西、江苏开展田间小区种植鉴定和SSR分子标记检测,将2种检测方法的结果进行相关性分析。结果(表1)表明,SSR分子标记纯度鉴定结果与田间检验结果存在一定差异,但偏差不大。各品种间2种方法鉴定结果的偏差存在一定差异,主要原因是Y两优689、株两优06等品种是两系杂交水稻,田间明显可辨的杂株多为不育系,与真品种性状很容易辨别;内5优8015、II优7954、钱优1号等品种是三系杂交水稻,杂株多由其他品种串粉形成,其籽粒形状,植株生育期都与真品种较接近,难以分辨,而利用SSR分子标记鉴定能将田间不能判断出的真异(杂)种子进行辨别,所以其得到的杂株率略高于田间小区鉴定结果,得出的杂交稻品种纯度结果更加可靠、准确。此外,周会[30]对23个杂交水稻品种的226份样品进行了SSR分子标记鉴定、田间正季种植鉴定和海南异地种植鉴定分析,结果表明SSR分子标记鉴定结果与田间正季鉴定基本一致,最大相差11.2百分点,平均差距为0.9百分点;而海南异地种植鉴定结果与正季鉴定结果差异较大,最大相差44.0百分点,平均差距为3.6百分点,据此认为SSR分子标记鉴定两系杂交水稻品种纯度结果比海南异地种植鉴定结果准确可靠。郭奕生等[31]利用SSR标记和田间小区种植鉴定同时对杂交稻品种进行了纯度鉴定,鉴定结果分别为93.0%和93.5%,结果很接近,说明利用SSR标记进行杂交稻种子纯度鉴定是可行的。

4 展望

种子纯度是水稻种子质量的核心标准之一,但种子纯度检测手段的不便性却长期困扰着中国水稻种子行业。将一套准确、快速、简单、经济的杂交水稻种子纯度检测技术推广到各种子企业,可满足种子企业生产经营的迫切需要,为企业种子质量监管提供技术保障,防止纯度不合格种子流入市场,有效维护种子企业诚信品牌和良好形象,进而增强企业的市场竞争力。

表1 不同水稻品种室内纯度检测与田间鉴定结果对比

传统的田间小区种植鉴定虽然是国家标准规定的方法,也是目前公认的最准确、可靠的方法,但由于其耗时费力、鉴定周期长,导致鉴定结果常滞后于种子销售,因而不适应于种子销售企业。SSR分子标记鉴定具备标记数量众多、提供的信息量大,检测程序简单、费用低,且不受外界环境因素影响,便于实现自动化以及结果准确等特点,非常适用于大规模的种子纯度快速检测。选用多态性高的引物,可有效提高工作效率,降低成本。因此,应继续开发新的多态性高的SSR引物,且引物应尽量均匀分布在染色体上,以便更全面地反映品种遗传信息,使鉴定结果更加准确可靠。

[1] Hampton J G.What is seed quality?[J].Seed Science and Technology,2002,30(1):1-10.

[2] 颜启传.种子学[M].北京:中国农业出版社,2001.

[3] 曹艳茹.浙江省水稻种子质量现状问题与对策[D].杭州:浙江农林大学,2013.

[4] 吴秋华,张春娇,张宝顺.玉米种子纯度鉴定技术概述[J].种子世界,2014(12):16-19.

[5] 郭承亮.SSR分子标记在杂交稻种子纯度精确鉴定中的应用[J].中国种业,2014(1):21-23.

[6] 陈贺,王海燕,杨奇,等.种子蛋白质与品种的真实性和纯度鉴定[J].新疆农业科学,2003,40(2):125-126.

[7] 吴建梅,吴明霞,卢勤,等.酯酶同工酶电泳法鉴定特优组合种子纯度效果研究[J].福建稻麦科技,2003,21(2): 18-20.

[8] 黎杰强,彭艺,徐翔飞,等.酯酶同工酶电泳鉴定天优122、培杂双七种子纯度研究[J].广东农业科学,2005(5): 22-24.

[9] 庄淑芳.同工酶电泳技术在杂交水稻种子纯度鉴定中的应用探析[J].福建农业学报,2004,19(4):247-249.

[10] 严敏,王晓峰.杂交玉米、水稻和辣椒种子品种真实性和纯度的室内快速鉴定[J].华南农业大学学报:自然科学版,2003,24(2):6-8.

[11] 张凤,陈伟.杂交水稻种子纯度鉴定方法概述[J].种子, 2004(9):55-58.

[12] 邢宝田,吴萍,宋顺华,等.SDS-PAGE凝胶电泳法与田间种植法鉴定辣椒种子纯度的相关性研究[J].北方园艺, 2011(13):29-31.

[13] 刘春,王红玲,崔竹梅,等.利用SDS-PAGE鉴定水稻品种(组合)的真实性和纯度[J].种子,2006,25(1): 23-25.

[14] 林艳,梅承芳,董建军,等.利用蛋白质“指纹”技术鉴定加拿大啤酒大麦的品种和纯度[J].食品与发酵工业, 2005,31(6):97-100.

[15] 张雪,李爽,韩玉珠.利用种子蛋白SDS-PAGE电泳谱带鉴定菜豆品种真实性与纯度的研究[J].北方园艺,2014 (7):91-95.

[16] 赵久然,王凤格.玉米品种DNA指纹鉴定技术研究与应用[M].北京:中国农业科学技术出版社,2009.

[17] 傅荣昭,邵鹏柱,高文远,等.DNA分子标记技术及其在药用植物研究上的应用前景[J].生物工程进展,1998,18 (4):14-17.

[18] 方宣钧,刘思衡,江树业.品种纯度和真伪的DNA分子标记鉴定及其应用[J].农业生物技术学报,2000,8(2): 106-110.

[19] 史全良,吴均章.植物系统学研究中常用基因分子标记特点分析[J].生物学通报,2000,35(12):4-6.

[20] 方宣钧,吴为人,唐纪良.作物DNA标记辅助育种[M].北京:科学出版社,2001.

[21] 彭锁堂,庄杰云,颜启传,等.我国主要杂交水稻组合及其亲本SSR标记和纯度鉴定[J].中国水稻科学,2003,17 (1):1-5.

[22] 刘之熙,陈祖武,朱克永,等.利用SSR分子标记快速鉴定杂交水稻种子纯度技术体系的优化[J].杂交水稻,2008, 23(1):60-63.

[23] Powell W,Morgante M,Andre C,et al.The comparison of RFLP,RAPD,AFLP and SSR(microsatellite)markers for germplasm analysis[J].Molecular Breeding,1996,2(3): 225-238.

[24] 汪爱顺,李进波,刘汉珍.DNA指纹用于杂交水稻种子纯度和真伪鉴定的研究进展[J].分子植物育种,2005,3 (3):393-400.

[25] 郭承亮,袁国保,耿月明,等.利用SSR标记鉴定两系杂交稻种子纯度[J].中国种业,2011(11):40-43.

[26] 李进波,杨国才,费震江,等.两优932中不同串粉混杂株型的DNA指纹分析[J].分子植物育种,2005,3(2): 209-212.

[27] Attaviroj N,Kasemsumran S,Noomhorm A.Rapid variety identification of pure rough rice by Fourier-transform nearinfrared spectroscopy[J].Cereal Chemistry,2011,88(5): 490-496.

[28] 夏运海,陈世建.利用三亚气候进行杂交水稻种子纯度鉴定的意义及技术措施[J].种子,2014,33(10): 133-134.

[29] 胡景涛,黄文章,严明建.几种杂交水稻种子纯度鉴定的方法及其应用前景[J].安徽农业科学,2009,37(4): 1493-1495.

[30] 周会.利用分子生物学技术鉴定农作物品种真实性和纯度[D].雅安:四川农业大学,2012.

[31] 郭奕生,陆俊.微卫星标记在杂交稻种子纯度鉴定上的应用[J].广东农业科学,2014,41(16):138-141.

(责任编辑：高 峻)

S 338

A

0528-9017(2015)05-0718-04

2015-03-26

浙江省重大专项(2013c02005)

曹栋栋(1983-),男,浙江宁波人,助理研究员,博士,从事种子生理生化、种子质量研究及种子推广工作。E-mail: jellycao@163.com。