阿达木单抗ELISA定量检测方法的建立

邹有土，白羊，葛平辉，阮卡，陈星

·技术与方法·

阿达木单抗ELISA定量检测方法的建立

邹有土，白羊，葛平辉，阮卡，陈星

治疗性单抗药物已经成为生物医药的重要组成部分，在疾病治疗上具有广阔的应用前景，成功用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等多种疾病。随着研究的深入及技术的进步，治疗性单抗药物呈现出良好的发展势头［1-2］。阿达木单抗是一种全人源的 IgG1型单克隆抗体，可靶向作用于在自身免疫疾病发病机制中起重要作用的促炎细胞因子——人肿瘤坏死因子（TNF-α）。类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）、多关节型幼年特发性关节炎（juvenile idiopathic arthritis，JIA）、银屑病关节炎（psoriatic arthritis，PsA）和强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）患者关节滑液中均发现 TNF-α水平增高，这与炎症发生和关节破坏密切相关［3-4］。阿达木单抗可特异性、高亲和地与TNF-α结合，并阻止它与细胞表面 TNF-α受体 p55和p75结合，从而拮抗 TNF-α的生物活性，减少表皮厚度和炎性细胞浸润［5-6］。

由于阿达木单抗的特殊疗效及其巨大的市场份额，许多医药企业通过生物仿制药的方式加入到该产品的开发和生产中。在开发和生产过程中必须建立起严格高效的质量控制方法，而含量的测定是重要的项目控制之一。本研究以hTNF抗原为包被抗原，羊抗人 IgG-HRP为检测抗体，建立了定量测定阿达木单抗的 ELISA方法，并对该方法进行了方法学研究。

1 材料与方法

1.1 材料

阿达木单抗注射液（修美乐，Humira）购自美国雅培制药；牛血清白蛋白（BSA）购自美国 Roche公司；hTNF抗原购自美国 BD Pharmingen公司；TMB购自美国 Fisher Scientific公司；羊抗人 IgG（H+L）-HRP购自美国 Pierce公司；吐温 20为美国 Amresco公司分装；其他常规试剂为国产分析纯产品；苯乙烯 96孔板购自丹麦 Nunc公司；Sunrise型酶标仪购自瑞士 Tecan公司。阿达木单抗发酵液、空白细胞株（不含阿达木单抗基因的细胞株）发酵液、辅料溶液（按阿达木单抗注射液处方的辅料组成制得的空白对照品溶液）均为本公司提供。

1.2 方法

1.2.1 试剂配制 将阿达木单抗注射液稀释至 1 ng/ml，之后再对倍系列稀释到所需浓度。

1.2.2 含量检测 用 pH 9.6的包被缓冲液稀释 hTNF抗原后包被 96孔板，4℃ 过夜。洗板 3次，拍干，加封闭液 200 μl/孔，室温封闭 2 h，洗板 3次，拍干。加入不同浓度的标准品或待测样品 100 μl，37℃ 孵育 1 h，洗板6次，拍干，加检测抗体 1∶10000，100 μl/孔，室温孵育1 h。洗板 6次，拍干，加 TMB显色液 100 μl/孔，室温孵育 15 min，加终止液 100 μl/孔，测定 OD450值。

1.2.3 方法学研究

1.2.3.1 线性范围 用 0.5 μg/ml的 hTNF抗原包被酶标板，将阿达木单抗注射液稀释至 8.0 ng/ml，然后进行倍比稀释，共 16个浓度梯度，每一稀释度设 3个平行孔，分别加入酶标板，加酶标检测抗体羊抗人IgG-HRP，显色，检测 OD450值，以阿达木单抗浓度为横坐标，相应的 OD450值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.3.2 包被浓度与酶标抗体浓度的优化 用包被缓冲液将包被抗原 hTNF稀释至 100、50、20 ng/ml三个浓度，各包被 3条标准曲线试验所用的酶标孔。用抗体稀释液将检测抗体羊抗人 IgG-HRP稀释至 1∶5000、1∶10000、1∶15000三个浓度，每个浓度的检测抗体分别加入到 100、50、20 ng/ml三个浓度的 hTNF包被的酶标板上，得到9条标准曲线。

1.2.3.3 灵敏度 空白样品检测 10次，计算 10个阴性孔 OD450的平均值（x）和标准差（S），从标准曲线中找到+2S相应值的浓度定为该 ELISA方法的检测限。根据标准曲线的线性范围确定定量限。

1.2.3.4 特异性 对所建立的 ELISA检测方法进行特异性分析。分别添加曲妥珠单抗、贝伐珠单抗、空白细胞株发酵液、辅料溶液，考察该方法的特异性。

1.2.3.5 准确度 配制高（0.80 ng/ml）、中（0.20 ng/ml）、低（0.02 ng/ml）三个浓度的阿达木单抗溶液，分别加入到空白细胞株发酵液中，采用与标准曲线同时测定的方法，在一次实验中每个浓度点测 5孔，计算平均回收率。

1.2.3.6 精密度 配制高（0.80 ng/ml）、中（0.20 ng/ml）、低（0.02 ng/ml）三个浓度的阿达木单抗溶液，采用与标准曲线同时测定的方法，在一次实验中每个浓度点测 5孔，计算批内变异系数。连续测 5批次，计算批间变异系数。1.2.3.7 稳定性 采用与标准曲线同时测定的方法，即每天新配制标准溶液作标准曲线，连续 8 d测定并绘制标准曲线，比较曲线的漂移。

1.3 统计学处理

采用 Microsoft Excel统计软件 t检验方法，对阿达木样品添加干扰物质后测得的 OD450值与单纯阿达木样品的OD450值进行统计学分析，以 P=0.05为显著性检验水准。

2 结果

2.1 线性范围

以阿达木单抗浓度为横坐标，相应的 OD450值为纵坐标，得标准曲线。实验结果表明，在 1.0～0.0078 ng/ml的浓度范围内 OD450和单抗浓度显示出良好的线性关系（r2= 0.9982），回归方程 y=1.7361x+0.0783，将此浓度范围定为 ELISA检测阿达木单抗的线性范围（图 1）。

2.2 包被浓度与酶标抗体浓度的优化

通过优化实验，共得到 9条标准曲线。实验结果表明，包被浓度为 50 ng/ml，检测抗体浓度为 1∶10000时，即能得到线性关系良好的标准曲线（y=0.9703x+0.0503，r2= 0.9995）（图 2），同时节约了包被抗原的用量，因此将此条件定为 ELISA检测阿达木单抗的合适条件。

图1 ELISA检测阿达木单抗的标准曲线

图2 不同包被浓度与检测抗体浓度的标准曲线

2.3 灵敏度

通过试验得出此 ELISA方法的检测限为 0.002 ng/ml；根据标准曲线的线性范围，定量限设为 0.0078 ng/ml。

2.4 特异性

添加曲妥珠单抗、贝伐珠单抗、空白细胞株发酵液、辅料溶液后测得的 OD450值均与无添加阿达木单抗溶液的OD450值相近，差异无统计学意义（P＞0.05），故该方法的特异性较好。

2.5 准确度

在 5次试验中，3个浓度点的回收率分别为（91.50± 9.2）%、（86.50±8.0）% 和（80.00±6.8）%（表 1）。

表1 回收率测定结果

2.6 精密度

试验结果显示，该检测方法的批内变异系数为 11.29%，批间变异系数为 12.60%（表 2、表 3）。

2.7 稳定性

通过连续 8 d的测定，发现各点 OD450值无明显下降，通过线性拟合，相关系数（r2）都能达到 0.99以上，说明该方法具有较好的稳定性。

表2 批内精密度测定结果

表3 批间精密度测定结果

3 讨论

目前常用 ELISA进行药物蛋白的定量检测。在重组单抗药物的发酵初期，表达量往往比较低，且发酵液中及纯化中间样品常含有其他的非目的蛋白，采用 ELISA进行定量检测，其检测限低，特异性高，可以准确地跟踪重组单抗药物的表达及纯化情况。

本研究建立了定量检测阿达木单抗的 ELISA方法，并进行了包被浓度与酶标抗体浓度的优化。数据显示优化后的ELISA方法在 1.0～0.0078 ng/ml浓度范围内，线性相关系数r2=0.9995；检测限为 0.002 ng/ml，定量限为 0.0078 ng/ml。在高浓度（0.80 ng/ml）条件下回收率为（91.50±9.2）%，中浓度（0.20 ng/ml）条件下回收率为（86.50±8.0）%，低浓度（0.02 ng/ml）条件下回收率为（80.00±6.8）%。同样，在中高浓度条件下，具有较低的变异系数（小于 10.0%）。由此可见，在测定阿达木单抗浓度时，将样品稀释至中、高浓度范围内，能够提高检测的准确度和精确度。实验还证明成品药中的辅料成分及检测样品中的培养基成分对阿达木单抗的检测均无干扰；8 d连续监测标准曲线稳定性良好。以上数据显示了 ELISA检测阿达木单抗良好的专属性、稳定性和适用性。

在单抗药物的含量测定中，可以使用理化的分光光度法、Lowry法和二辛可酸（BCA）法及 HPLC法，还可使用 ELISA法检测［7］。ELISA法是基于抗体特异性的免疫学方法，用相应的抗原进行包被，如检测阿达木单抗，则选择hTNF抗原作为包被抗原，从而具有很高的特异性。同时通过比较免疫学方法和理化方法测定的蛋白含量，还可以获得总蛋白中具有特异性结合活性的蛋白所占比例的相关信息，但是 ELISA法测定单抗制品中单抗含量的过程中，需对标准品的含量和活性精确标定，否则将使测定结果产生较大的误差［7］。根据各项实验结果表明，建立的 ELISA方法易于操作，快速高效，方法的准确性和精密度良好，可以用于阿达木单抗的含量测定，为该重组单克隆抗体的快速定量检验提供了方法学依据。

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“重大新药创制”国家科技重大专项（2011ZX09202-301-15）

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陈星，Email：15259203827@163.com

2014-12-08