HSP27与FAS/FASL在三阴性乳腺癌侵袭转移中的作用*

张凯丽 冀宏 王影 马维远

·临床研究与应用·

HSP27与FAS/FASL在三阴性乳腺癌侵袭转移中的作用*

张凯丽 冀宏 王影 马维远

目的：研究热休克蛋白27（HSP27）在三阴性乳腺癌（TNBC）中的表达与乳腺癌临床、病理指标之间的关系，探讨HSP27与细胞凋亡系统脂肪酸合成酶/脂肪酸合成酶配体（FAS/FASL）之间的相关性及其在TNBC侵袭转移中的作用。方法：采用免疫组织化学S-P法检测100例TNBC、100例非TNBC及50例癌旁组织中HSP27及FAS/FASL表达，对HSP27表达与TNBC临床及病理指标的相关性以及HSP27与FAS/FASL之间表达的相关性进行分析。结果：HSP27在TNBC中表达显著高于非TNBC及癌旁组织（P＜0.05），FAS/FASL在TNBC与非TNBC及癌旁组织中的表达差异具有统计学意义（P＜0.05）。HSP27与FAS的表达呈负相关（P＜0.05），HSP27与FASL的表达呈正相关（P＜0.05），FAS与FASL的表达呈负相关（P＜0.05）。HSP27在TNBC中表达与不同年龄、分期、肿瘤直径无相关性（P＞0.05），与有淋巴结转移、淋巴结转移枚数、P53、Ki-67的表达相关（P＜0.05）。结论：HSP27过表达与FAS/FASL系统表达失调可能促进TNBC细胞增殖侵袭及转移，导致不良预后。

三阴性乳腺癌 热休克蛋白27 脂肪酸合成酶 脂肪酸合成酶配体

HSP27是热休克蛋白家族的一员，作为分子伴侣具有稳定分子构象，具有维持细胞内环境稳定的作用。有关报道发现，其表达多少与某些肿瘤发生、侵袭转移、预后均有关［1］。脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，FAS）为存在于细胞表面的一种跨膜蛋白，脂肪酸合成酶配体（fatty acid synthetase ligand，FASL）为FAS受体，属于肿瘤坏死因子受体家族的成员，两者结合可以导致细胞凋亡［2］，是一条重要的细胞凋亡通路。FAS/FASL系统组成的凋亡通路可以诱导正常的细胞凋亡，但当某些因素导致凋亡通路受阻，两者表

达不平衡，就无法进行正常的细胞凋亡、代谢，进而诱发某些病变［3］。三阴性乳腺癌（TNBC）是近年来的研究热点，其治疗手段相对局限，内分泌治疗无效，靶向治疗不适宜，预后相对较差［4］。本研究通过对TNBC与非TNBC中HSP27和FAS/FASL的表达进行比较，探讨其在TNBC发生发展及侵袭转移过程中所起的作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验对象随机选取河北医科大学第二医院2009年1月至2012年12月间行乳腺癌改良根治术的女性患者的病理蜡块共200例，术后病理证实为乳腺癌，且病理资料完整。其中TNBC为100例（实验组），非TNBC为100例（对照组），另取癌旁组织50例。患者标本使用符合本院伦理委员会认可。

1.1.2实验试剂鼠抗人HSP27单克隆抗体（稀释度1:100）、FAS/FASL兔抗人多克隆抗体（稀释度1:100）、苏木素、枸橼酸缓冲液、SP-9001、显色剂DAB、二甲苯、酒精均购自河北博海生物工程开发有限公司。

1.2方法

1.2.1免疫组织化学法检测HSP27、FAS、FASL在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达将乳腺癌组织及癌旁组织的切片附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上，60℃过夜。脱蜡、入水，1%甲醇双氧水、室温10 min孵育。蒸馏水洗涤1次，0.1 mol/L PBS洗涤3次×5 min，滴加抗原修复液、室温10 min孵育。0.1 mol/L PBS洗涤3次×5 min，滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min孵育。甩去多余液体，滴加第一抗体（1:100），4℃过夜，0.1 mol/L PBS洗涤3次×5 min，滴加生物素第二抗体（IgG），37℃20 min孵育，0.1 mol/L PBS洗涤3次×5 min。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP），37℃20 min孵育，0.1 mol/L PBS洗涤3次×5 min。DAB显色，苏木素复染细胞核，显微镜观察、拍摄图像并进行分析。

1.2.2免疫组织化学结果判定HSP27、FAS、FASL呈棕黄色颗粒表达于乳腺癌细胞质及细胞膜，P53、Ki-67呈棕褐色颗粒表达于细胞核。选择5个视野进行免疫组织化学评分（IHS）。IHS=A×B，A为阳性细胞数分级，B为阳性细胞显色强度分级。阳性表达细胞数＜1%为0分，1%～10%为1分，11%～50%为2分，51%～80%为3分，81%～100%为4分。阳性细胞表达的着色深度：基本不着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。两者得分相乘，0分记为（-），1～4分为（+），5～8分为（++），9～12分为（+++）。HSP27、FAS、FASL（++～+++）为高表达，（-～+）为低表达［5］。

1.3统计学分析

采用SPSS13.0软件进行统计学分析。计数资料阳性表达率之间的比较采用χ2检验，HSP27、FAS、FASL之间的关系采用Spearman相关分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1HSP27、FAS/FASL在TNBC、非TNBC及癌旁组织中的表达

HSP27主要表达于乳腺癌组织的细胞膜、细胞质，呈棕黄色颗粒（图1A、1B），在癌旁组织呈低表达（图1C）。FAS、FASL主要表达于乳腺癌组织的细胞膜、细胞质，呈棕黄色颗粒（图2A、2B，图3A、3B），在癌旁组织中FAS呈高表达、FASL呈低表达（图2C，图3C）。

▶A.TNBC；B.Non-TNBC；C.Paraneoplastic tissues图1HSP27在乳腺癌及癌旁组织中的表达（S-P法×200）Figure 1Expression of HSP27 in breast cancer and paraneoplastic tissues（S-P× 200）

▶A.TNBC；B.Non-TNBC；C.Paraneoplastic tissues图2FAS在乳腺癌及癌旁组织中表达（S-P法×200）Figure 2Expression of FAS in breast cancer and paraneoplastic tissues（S-P× 200）

▶A:TNBC；B:Non-TNBC；C:Paraneoplastic tissues图3FASL在乳腺癌及癌旁组织中表达（S-P法×200）Figure 3Expression of FASL in breast cancer and paraneoplastic tissues（S-P× 200）

HSP27在TNBC中的表达率显著高于非TNBC及癌旁组织（P＜0.05），在TNBC与非TNBC及癌旁组织中的FAS与FASL表达差异具有统计学意义（P＜0.05，表1）。

表1 HSP27、FAS/FASL在TNBC、非TNBC及癌旁组织中表达的关系Table 1Expression of HSP27 and FAS/FASL in 100 TNBC tissue samples，100 non-TNBC tissue samples，and 50 paraneoplastic tissues

2.2HSP27、FAS、FASL在TNBC、非TNBC及癌旁组织中表达相关性的分析

HSP27、FAS、FASL在TNBC、非TNBC及癌旁组织中表达有相关性（图4）。采用Spearman相关分析，结果显示FAS与FASL的表达呈负相关（r=-0.183，P＜0.05），HSP27与FAS的表达呈负相关（r=-0.433，P＜ 0.05），HSP27与FASL的表达呈正相关（r=0.555，P＜0.05）。

图4 HSP27及FAS、FASL之间表达相关性分析Figure 4Correlation analyses among HSP27，FAS，and FASL expression

2.3HSP27在三阴性乳腺癌中的表达与临床病理指标间的关系

淋巴结转移者的HSP27阳性表达率高于无淋巴结转移者（P＜0.01），淋巴结转移枚数越多，HSP27阳性表达率越高（P＜0.01）；P53、Ki-67阳性者的HSP27阳性表达率高于阴性者（P＜0.05）。HSP27阳性率在不同年龄、肿瘤大小、组织学分级中的表达率差异无统计学意义（表2）。

表2 HSP27在TNBC中的表达及与临床病理指标间的关系Table 2Correlation of HSP27 expression in breast cancer with patients'clinicopathologic features and tumor markers

表2 HSP27在TNBC中的表达及与临床病理指标间的关系（续表2）Table 2Correlation of HSP27 expression in breast cancer with patients'clinicopathologic features and tumor markers

3 讨论

三阴性乳腺癌是乳腺癌的一个特殊类型，目前治疗较局限，除化疗以外，无相应的靶向治疗药物，预后较差，因此探讨TNBC的特异性靶点，对TNBC进行特异性治疗是目前的研究热点［6］。热休克蛋白家族在乳腺癌这个复杂的病理过程中起到的关键作用越来越受到重视。随着对HSP27与肿瘤关系研究的不断深入，发现HSP27是一个在细胞生长、细胞骨架的稳定、耐药性的产生、细胞凋亡、癌细胞转移等多方面起重要作用的蛋白［7］。HSP27在肺癌中的表达以及与骨肉瘤的预后关系已有报道［8］，在乳腺癌患者中HSP27也与术后短时间复发和转移有密切关系，HSP27能够增加乳腺癌的转移侵袭能力［9］，但是HSP27与三阴性乳腺癌转移侵袭的关系研究尚不多见。本研究的TNBC中HSP27表达明显高于非TNBC，有淋巴结转移者显著高于无淋巴结转移者（P＜0.01），淋巴结转移数目越多HSP27阳性表达率越高（P＜0.01），HSP27阳性的表达率在P53、Ki-67阳性者中显著高于阴性者（P＜0.05），说明HSP27过表达与三阴性乳腺癌的预后不良存在一定的相关性，而是否能成为其预后不良的独立相关因素尚待进一步研究。

有研究报道，HSP27在多种肿瘤细胞中高表达，可以通过抑制Caspase蛋白的激活和活性来抑制细胞凋亡［10］，通过抑制癌细胞较为缓慢的衰老途径及较为迅速的程序性死亡途径，从而促进癌细胞发生转移［11］。因此，本研究中HSP27在TNBC中过表达，可能抑制了三阴性乳腺癌细胞的凋亡和自噬，导致部分乳腺癌细胞只能以坏死方式死亡，其效率远低于凋亡，从而促进了三阴性乳腺癌的转移侵袭。另一方面，FAS属于肿瘤坏死因子及神经生长因子受体家族成员，是细胞凋亡信号受体，在许多肿瘤细胞中发现其表达，FASL在肿瘤发生发展过程中的免疫逃避机制中起重要作用［12］。在TNBC中HSP27过表达与FAS低表达，FASL高表达具有相关性，HSP27可能影响了FAS/FASL受体介导的肿瘤细胞凋亡通路［13］，HSP27直接与死亡结构域蛋白（Daxx）互相作用，特异地影响Daxx通路，抑制Daxx结合到细胞膜，进而抑制其与FAS/FASL的相互作用，最终抑制Daxx诱导肿瘤细胞凋亡［14］。FAS/FASL系统不仅是引起凋亡的重要途径，也是细胞免疫毒性杀伤靶细胞的途径之一［15］。在三阴性乳腺癌中FAS表达下调，抵抗FAS介导的凋亡，逃避免疫监视和免疫杀伤，FASL表达上调又会引起表达FAS的T细胞凋亡，破坏自身的免疫系统，肿瘤细胞从而可以逃避T细胞而增殖。

总之，HSP27过表达以及FAS/FASL系统表达失调因素导致肿瘤细胞凋亡系统不能正常运行，可能对三阴性乳腺癌细胞增殖、侵袭及转移起到了促进作用，导致不良预后。

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（2014-10-22收稿）

（2015-01-23修回）

Research on the role of HSP27 and Fas/Fasl in the invasion and metastasis of triple negative breast cancer

Kaili ZHANG,Hong JI,Ying WANG,Weiyuan MA

Kaili ZHANG;E-mail:13833172900@163.com

Objective:To study the relationship between the expression of heat shock protein 27(HSP27)in triple negative breast cancer(TNBC)and the clinico-pathological indexes of breast cancer,investigate the correlation between HSP27 and the fatty acid synthetase(FAS)/fatty acid synthetase ligand(FASL)of the cell apoptosis system in the Fas/Fasl system,and study the role of HSP27 in the invasion and metastasis of TNBC.Methods:The immunohistochemical S-P method was used to detect the expression of HSP27 and(FAS)/(FASL)in 100 TNBS tissue sampres,100 non-TNBS tissue sampres,and 50 paraneoplastic tissues.This method was also used to analyze the correlations between the expression of HSP27 and the clinical and pathological indexes of TNBC,as well as between the HSP27 expression and FAS/FASL expression.Results:HSP27 expression was significantly higher in TNBC than in the non-TNBC and paraneoplastic tissues(P<0.05).Statistically significant differences were observed in the FAS/FASL expression in the TNBC,non-TNBC,and paraneoplastic tissues(P<0.05).HSP27 expression had a negative correlation with FAS expression(P<0.05). HSP27 expression was positively correlated with FASL expression(P<0.05).FAS expression had a negative correlation with FASL expression(P<0.05).HSP27 expression in TNBC was not correlated with age,staging,and tumor size(P>0.05),whereas HSP27 expression was correlated with lymph node metastasis,number of nodal metastases,and P53 and Ki67 expression(P<0.05).Conclusion:The overexpression of HSP27 and the expression dysregulation of the FAS/FASL system may play a role in promoting TNBC transfer and invasion,cell proliferation,and poor prognosis.

triple negative breast cancer,HSP27,fatty acid synthetase,fatty acid synthetase ligand

10.3969/j.issn.1000-8179.20141741

河北医科大学第二医院腺体外科（石家庄市050000）

*本文课题受河北省医学科学研究重点课题计划（编号：20120077）资助

张凯丽13833172900@163.com

Department of Gland Surgery,The Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,China

This work was supported by the Key Research Project of Medical Science in Hebei Province(No.20120077)

张凯丽专业方向为甲状腺、乳腺肿瘤临床及基础研究，肿瘤信号转导通路机制研究。

E-mail：13833172900@163.com