牙乳头/牙囊细胞交互作用对细胞多能性的作用

刘 路, 彭正军, 韦 曦, 许喆桢

(中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院，广东省口腔医学重点实验室, 广东 广州 510055)

·基础研究·

牙乳头/牙囊细胞交互作用对细胞多能性的作用

刘 路, 彭正军, 韦 曦, 许喆桢

(中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院，广东省口腔医学重点实验室, 广东 广州 510055)

目的: 研究细胞交互作用对细胞多能性的调控作用。方法：建立牙乳头(DPCs)和牙囊细胞(DFCs)体外共培养模型，二者单独培养的细胞为对照组。采用细胞计数、β- gal染色检测细胞生长和衰老情况；免疫荧光染色检测共培养条件下多能性相关因子Oct- 4、Sox2和c- Myc的表达变化；通过ALP活性测试检测矿化诱导后的DPCs和DFCs的矿化能力。结果：共培养组的DPCs和DFCs的细胞数明显高于对照组(P<0.05)；培养至第7代时，共培养组的DPCs、DFCs中与衰老相关的SA- b- gal表达较对照组明显减弱(P<0.05)；Oct- 4、Sox2和c- Myc在共培养组DPCs和DFCs中的表达明显强于对照组；共培养组的DPCs和DFCs经矿化诱导14、21 d后，其ALP活性均显著高于对照组(P<0.05)。结论：DPCs和DFCs可通过体外交互作用抑制细胞衰老、促进细胞的多能性相关因子的表达、提高细胞的矿化能力。

牙乳头细胞; 牙囊细胞; 微环境; 多能性

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.02.001

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(2):63]

牙乳头细胞(dental papilla cells，DPCs)和牙囊细胞(dental follicle cells, DFCs)均来自外胚间充质，具有成骨、成脂、成软骨等多向分化潜能[1]。DPCs和DFCs作为牙髓细胞和牙周韧带细胞的前体细胞，在牙发育和再生中具有重要作用，是构建生物牙根的种子细胞。然而，DPCs和DFCs干细胞比例低，难以纯化筛选，从而限制了其在口腔再生医学中的应用[1]。由于细胞性能由内源性信号和细胞外微环境共同决定，通过改变细胞培养微环境和细胞间交互作用，在提高前体细胞多能性，改善其性能，优化种子细胞后，可应用于组织修复再生。但细胞间及细胞-微环境间的具体作用机制尚未明确[2]。

本课题组前期研究已发现，体外传代培养过程中扩增早期的牙髓细胞中多能性因子Oct- 4、Sox2和c- Myc的表达水平较高，此后其表达随细胞传代而下降，并最终消失；细胞的多能性亦随传代而下降[3]。能否模拟体内牙齿发育的微环境，通过DPCs与DFCs的交互作用调控细胞的性能，目前尚未明确。因此，本实验分别采用β- gal染色、免疫荧光染色和ALP活性检测等方法，观察DPCs与DFCs交互作用对细胞生长、衰老、多能性相关因子表达和分化能力的影响，以探讨细胞培养微环境对牙源性细胞未分化性能的调控作用，并为口腔种子细胞在牙再生的临床应用提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

特级胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS, Gibeco- BRL, 荷兰)；α- MEM培养基、Ⅰ型胶原酶(Worthington, 美国)；Dispase(GIBCO- BRL, 荷兰)；2.5 g/L胰蛋白酶(Sigma, 澳大利亚); 猪血清(Dako，澳大利亚)；鼠抗人Oct- 4单克隆抗体(Chemicon,美国)；鼠抗人Sox2单克隆抗体(R&D System，美国)；鼠抗人c- Myc单克隆抗体(Santa cruz，美国)；荧光二抗、DAPI(Invitrogen，澳大利亚)；碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)试剂盒(南京建成公司); Transwell 小室(Corning, Tewksbury, MA, 美国); 胶室玻片(chamber slides，Nunc, 美国)。

1.2 方法

1.2.1 DPCs和DFCs细胞体外培养

参照文献[1]报道的方法体外培养出生后7 d SD大鼠(中山大学动物实验中心)的DPCs和DFCs：显微镜下取大鼠磨牙牙胚并分离取出牙乳头和牙囊组织，分别浸泡于含青霉素500 U/mL、链霉素500 μg/mL的PBS溶液中将其剪碎后，以1 ∶1的比例加入3 mg/mL的Ⅰ型胶原酶和4 mg/mL的dispase酶37 ℃消化20～45 min终止消化后，用含200 mL/L FBS的α- MEM重悬细胞并分别接种于6孔培养板，置于50 mL/L CO2、饱和湿度的37 ℃恒温培养箱中进行培养。48 h半量换液，以后每3 d 换液1次，待细胞汇合达70%～80%时，2.5 g/L 胰酶消化，1 ∶3传代。

1.2.2 建立DPCs和DFCs体外细胞共培养模型

采用孔径为0.4 mm的Transwell小室建立DPCs和DFCs体外细胞共培养模型：将DPCs和DFCs以1×103/孔 的细胞密度分别接种于共培养模型组小室的上下层(对照组小室的上下层均为同种细胞)，并同时加入含100 mL/L FBS的α- MEM，置于50 mL/L CO2、饱和湿度的37 ℃恒温培养箱中进行培养。48 h半量换液，以后每3 d换液1次。

1.2.3 细胞计数

上述培养5 d后，分别取共培养组和对照组的DPCs和DFCs，用2.5 g/L胰酶消化、PBS洗净后重悬于10 mL培养基中； 然后取50 μL各细胞悬液，分别加入50 μL台盼蓝进行染色后，用细胞计数板进行细胞计数。实验重复3次。

1.2.4 β- gal染色检测细胞衰老

采用与细胞衰老相关的β- gal染色法(Beta-galactosidase staining)检测各组细胞的衰老情况。分别取共培养组和对照组的第3、7代DPCs和DFCs，以1×103/孔的细胞密度接种于24孔板，并用PBS洗净；然后按照β- galactosidase试剂盒(Cell Signaling Technology)说明书，在每孔中加入pH=6.0的X- gal发色底物，37 ℃下培养过夜；荧光显微镜下观察与衰老相关的SA- b- gal的表达情况。

1.2.5 免疫细胞荧光染色

分别收集对照组和共培养组的第5代DPCs和DFCs，以1×104/mL 细胞密度接种于胶室玻片，用30 g/L多聚甲醛固定15 min后, 滴加1 g/L Triton常温处理20 min； 100 mL/L猪血清常温封闭1 h； 然后再分别滴加Oct- 4单克隆抗体、Sox2单克隆抗体、c- Myc单克隆抗体，并置于湿盒4 ℃过夜； PBS漂洗3次后，用荧光标记的二抗(1 ∶150)常温处理3 h; 再次用PBS漂洗3次后滴加DAPI(1 ∶1 400)，并用100 g/L甘油封片。最后在荧光显微镜下进行观察，并用Axion图像分析软件分析Oct- 4、Sox2、c- Myc 在DPCs和DFCs中的表达、分布情况。

1.2.6 矿化诱导和ALP活性测试

共培养组和对照组细胞生长至80%汇合时换用矿化诱导液(含10 mmol/L β甘油磷酸钠、0.2 mmol/L抗坏血酸、100 nmoL/L 地塞米松、150 mL/L FBS的α- MEM)继续培养；并分别于培养0、7、14、21 d各时间点，采用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测ALP活性。具体步骤如下：分别取共培养组和对照组的DPCs和DFCs，用PBS洗净3次后加入1 mL含1 g/L Triton X-100的 10 mmol/L Tris- HCl缓冲液，超声震荡40 s(重复5次)；4 ℃离心15 min后，取50 mL上清液转移至24孔板，同时加入100 mL ALP底物与之混合后置于37 ℃静置30 min；加入50 mL 0.2 mol/L NaOH终止反应后，用酶联免疫吸附法分别检测各孔 410 nm 波长处的吸光度值，以间接反映各组细胞的ALP活性。

1.3 统计学分析

2 结果

细胞计数显示，共培养组的DPCs和DFCs细胞数均显著高于对照组(P<0.05)(图1)。β- gal染色显示：培养第3代时，共培养组的DPCs(图2b)、DFCs(图2f)和对照组的DPCs(图2a)、DFCs(图2e)均无明显染色，即与衰老相关的SA- b- gal呈阴性表达；培养第7代时，对照组的DPCs(图2c)和DFCs(图2g)均强阳性表达SA- b- gal(蓝色染色)，而共培养

组的DPCs(图2d)和DFCs(图2h)仅部分细胞中SA- b- gal呈极弱的阳性表达(蓝色染色)。以上结果提示，传代后期的DPCs和DFCs可通过细胞交互作用抑制细胞衰老。

培养第5代时免疫细胞荧光染色显示，Oct- 4(图3a、b、g、h)、Sox2(图3c、d、i、j)和c- Myc(图3e、f、k、l)在共培养组的DPCs(图3b、d、f)和DFCs(图3h、j、l)中的表达均显著强于对照组(图3a、c、e、g、i、k)； 且均为细胞核强表达，细胞浆弱表达(绿色荧光)(图3)。

共培养组和对照组的DPCs、DFCs经矿化诱导0～21 d不同时间后，ALP检测结果显示：各组各细胞的ALP活性均呈时间依赖性增长；共培养组各细胞与对照组各细胞的ALP活性相比，除矿化诱导0、7 d时两者无统计学差异(P>0.05)外，其他各时间点均为共培养组高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)(图4)。

*与对照组相比P<0.05

a、b为第3代DPCs对照组和共培养组； c、d为第7代DPCs对照组和共培养组; e、f为第3代DFCs对照组和共培养组; g、h为第7代DFCs对照组和共培养组; 第3代时，各组各细胞均无明显染色(a、b、e、d)； 第7代时，对照组DPCs(c)和DFCs(g)中SA- b- gal均呈强阳性表达(蓝色)，而共培养组的DPCs(d)和DFCs(h)中SA- b- gal均呈极弱的阳性表达

图2 对照组和共培养组DPCs和DFCs β-gal染色(×100)

Oct-4(a、b、g、h)、Sox2(c、d、i、j)和c-Myc(e、f、k、l)在共培养组的DPCs(b、d、f)和DFCs(h、j、l)中的表达均显著强于对照组(a、c、e、g、i、k)，且均为细胞核强表达，在细胞浆弱表达(绿色荧光)

图3 各组DPCs和DFCs中Oct-4、Sox2、c- Myc的表达(免疫细胞荧光染色，×200)

图4 矿化诱导后各组DPCs和DFCs的ALP活性比较(*与对照组相比P<0.05)

3 讨论

前体/干细胞存在于某种特定的微环境内，与环境相互作用、相互依存。一旦脱离了该微环境，或微环境发生了改变，细胞性能将受到影响，干性降低甚至丧失[4]。近年来有学者提出，通过优化细胞的培养条件和细胞微环境，可改良细胞的干性，甚至能诱导细胞重编程为未分化的前体细胞。有研究发现，热刺激、低氧、缺血及氧化等应激状态可激活相关信号通路，从而促使已分化的体细胞重编程为未分化状态的前体/干细胞，并行使其修复功能[5]。另有研究发现，低氧可激活Oct4启动子受体，促进干细胞标记物 TRA1- 60和SSEA4的表达，提高其自我更新和畸胎瘤形成能力，诱导细胞重编程[6]。然而，微环境改变对细胞重编程的研究尚处于起步阶段，其分子机制、信号通路交汇点、重编程与微环境的关系尚未明确。

滋养层细胞(feeder layer)用作底物同化培养液，可为细胞生长提供必要的生长因子，并能优化微环境、去除体外培养环境中的毒素和代谢因子[7]。最近研究发现，以人羊膜上皮细胞(human amnion epithelial cells, hAECs)作为滋养层细胞可向培养液分泌LIF，小鼠原始胚胎干细胞(prime embryonic stem cells)可在滋养层细胞hAECs和LIF、BMP- 4的作用下重编程为更原始的幼稚ESCs(naive embryonic stem cells)，并显著提高Oct- 4、Sox2、FGF4和Nanog的表达水平[8]。以年轻患者的牙周韧带干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)作为滋养层细胞，可通过细胞间相互作用逆转老年患者的PDLSCs细胞的衰老现象，并能激活其细胞的多能性[9]。因此，细胞可能通过接触和非接触途径提供其生长的微环境和信号，从而促进细胞增殖、维持干细胞的性能、阻止分化[10]。

DPCs和DFCs是牙发育和再生的重要种子细胞，然而来源有限，加之其多能性和再生能力会随体外传代培养而消失，从而限制了其在口腔再生医学中的应用[1、11]。本课题组前期研究已证实，长期体外传代培养的种子细胞多能性显著降低，再生能力减弱，出现细胞老化[3]。然而，细胞老化是否可逆，可否模拟体内微环境调控细胞多能性等问题仍然未得到解答。在体内牙发育过程中，DPCs和DFCs相互接触，相互作用，并在特定的微环境下生成了牙组织的特殊结构[12]。为探讨细胞交互作用与体外培养细胞生长、细胞老化的关系，本实验通过建立DPCs和DFCs体外共培养模型模拟体内牙发育的微环境，观察细胞间交互作用对体外培养的DPCs和DFCs生长、衰老变化的影响。结果显示，经共培养的DPCs和DFCs的细胞数量显著高于对照组；培养至第7代时，共培养组的DPCs和DFCs的细胞衰老较对照组明显降低。提示，该培养体系可促进DPCs、DFCs的生长，并能抑制细胞衰老。

有研究表明，Oct- 4和Sox2可通过协同作用维持ESCs的多能性，当其表达丧失时可导致细胞的多能性、分化能力及iPSCs克隆形成能力丧失[13]。Oct- 4/Sox2 复合体在ESCs重编程信号中处于核心地位，可启动c- Myc、Klf4、FGF4 和Nanog等转录因子的表达，从而调控细胞的多能性。因此Oct- 4、Sox2 和c- Myc与细胞多能性和重编程能力密切相关[14-15]。本课题组前期研究发现，Oct- 4、Sox2 和c- Myc 均参与体内牙髓牙本质复合体和牙周附着的损伤修复，对牙髓和牙周韧带组织损伤修复具有重要的调控作用[16]。本结果发现， DPCs/DFCs交互作用可调节体外培养微环境，并能显著提高内源性Oct- 4、Sox2和c- Myc的表达、增强细胞的矿化能力； 提示，调节细胞培养微环境对维持DPCs传代过程中的未分化性能有积极意义。

综上所述，本实验检测了DPCs/DFCs交互作用对细胞生长、衰老、多能性因子表达和分化能力的调控作用，并证实DPCs/DFCs交互作用可促进细胞的生长、抑制细胞衰老、提高多能性因子表达和细胞体外矿化能力； 提示细胞培养微环境可调控细胞多能性。

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The effects of cell- cell interaction of dental papilla cells and dental follicle cells on cell pluripotency

LIU Lu, PENG Zheng- jun, WEI Xi, XU Zhe- zhen

(GuanghuaSchoolofStomatology,AffiliatedStomatologicalHospital,GuangdongProvincialKeyLaboratoryofStomatology,SunYat-senUniversity,Guangzhou510055,China)

AIM: To investigate the effect of cell- cell interaction of dental papilla cells (DPCs) and dental follicle cells (DFCs) on the pluripotency of the cells. METHODS: An in vitro cell- cell co- culture system of DPCs and DFCs was established. Cell growth, cell senescence and the expression of Oct- 4, Sox2 and c- Myc were investigated by cell counting, β- gal staining and immunohistochemical staining. The odontogenic differentiation capability of DPCs and DFCs was evaluated by ALP activity assay after 0, 7, 14, and 21 d of osteogenic induction. RESULTS: Under co- culture condition, cell growth of DPCs and DFCs was promoted, and cell senescence of DPCs and DFCs was inhibited. Expression of Oct- 4, Sox2 and c- Myc was significantly elevated in both cells on day 5 after coculture. ALP activity was significantly upregulated in both cells after 14d and 21d of odontogenic induction. CONCLUSION: Optimized microenvironment with cell- cell communication may enhance the pluripotency potential of DPCs and DFCs.

dental papilla cells (DPCs); dental follicle cells (DFCs); microenvironment; pluripotency

2014-08-29

国家自然科学基金资助项目(81400499) 高等学校博士学科点专项科研基金(20120171120070)

刘路(1981-)，女，汉族，广东惠州人。博士，副主任医师

韦曦, E-mail: weixi@mail.sysu.edu.cn

R780.2

A

1005-2593(2015)02-0063-05

广东省医学科研基金(B2012141)

中央高校基本科研业务费专项资金(11ykpy51)