灰树花子实体转录组测序和分析

袁卫东，陆 娜，陈 青，宋吉玲，王伟科

（1.杭州市农业科学研究院，杭州 310024；2.浙江省农业技术推广中心，杭州 310020）

灰树花（Grifola frondosa，maitake）是一种食、药兼用的珍稀蕈菌［1］，野生灰树花常生长于栗树周边，俗称“栗蘑”.子实体香气宜人，口感嫩脆鲜美；同时药用价值极高，主要用于消化道、乳腺及前列腺等癌症的治疗，此外也用于血管硬化、血压增高及心脏等疾病的治疗，因此具有良好的开发前景［2］.

选育出优质、高产、抗逆性强的灰树花品种，提高其经济效益，一直是灰树花遗传育种工作研究的重点［3］.转录组学研究作为一种快速、高通量、全面解读食用真菌的全新技术手段，已经被越来越广泛地应用于食用菌的遗传育种工作中［4］.食用菌转录组的研究，可从整体水平上发掘食用菌药用成分生物合成途径中的关键基因，确定有效药用活性成分的合成途径及其调控机制，为食用菌功能基因的挖掘、品种鉴定、资源保护和种质繁育提供新的思路和方法［5］.

我们通过对灰树花子实体转录组的测序研究，筛选出灰树花子实体成熟期特异表达基因，并对这些表达的基因进行生物信息学分析，旨在发现灰树花子实体生长过程中的相关基因，为通过基因工程培育优质、高产的灰树花新品种提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 试材

供试菌株为灰树花小黑汀，引自山东泰安.菌丝长满菌包后移入出菇大棚培养7～10d，待菌丝扭结形成原基后25d左右形成成熟的灰树花子实体，收集成熟的子实体样品.

1.2 方法

1.2.1 灰树花子实体总RNA 提取及测序

用TRIzol法提取灰树花子实体总RNA，并用RNAeasy plant mini kit对提取的总RNA进行纯化，70℃变性2min后，NanoDrop ND－2000检测其浓度、琼脂糖凝胶电泳分析RNA 的完整性［6］.检测合格的RNA 用于mRNA的富集及cDNA的合成.用Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina进行文库构建，纯化后Agilent High Sensitivity DNA Kit检测文库插入片段大小，定量后Illumina HiSeqTM2000对建好的测序文库进行测序［7］.

1.2.2 测序数据分析

使用Trinity（版本r20131110，默认参数）对RNA－seq的原始reads数据进行拼接，最短contig长度为200.对Trinity拼接结果使用Cap3进行进一步拼接获得Unigene［8］.

1.2.3 Unigene的NR 数据库比对分析

利用Blast进行Unigene的NR 数据库物种分布比对分析［9］，统计Blast结果中每个能比对上的物种所对应的Unigene数目，按该数目从高到低进行排序，选取数目较高的前10个物种，其他比对上的物种对应的Unigene数目相加作为others，没有比对上的物种的Unigene数目相加则是unmatched.

1.2.4 Unigene的GO 分类

根据NR 注释信息，对Unigene进行GO 注释［10］（Blast2GO），得到每个Unigene的GO 注释.并对所有Unigene做GO 功能分类统计（WEGO），从细胞组成、分子功能及生物过程（biological process）三方面认识灰树花的基因功能分布特征.

1.2.5 Unigene的COG 功能注释

将Unigene和COG 数据库（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／Structure／bwrpsb／bwrpsb.cgi）比对分析，预测Unigene功能并对其分类统计，这有利于我们进一步了解灰树花各Unigene的生物学功能.

1.2.6 Unigene的代谢通路分析

使用http：∥www.genome.jp／tools／kaas／对Unigene进行KEGG 注释，以便于进一步研究灰树花基因在生物学上的复杂行为，系统分析其基因在细胞中的代谢通路及功能.

1.2.7 Unigene的SSR 信息分析

对拼接得到Unigene进行SSR 简单重复序列的查找.筛选标准：单核苷酸重复的次数在10次或10次以上，二核苷酸重复的次数在6次或6次以上，三至六核苷酸重复的次数在5次或5次以上.同时，也筛选中间被少数碱基（间隔小于100或等于100）打断的不完全重复的SSR.利用MISA（http：∥pgrc.ipkgatersleben.de／misa／）工具提供批量识别和定位简单重复序列（SSR）.

2 结果与分析

2.1 RNA提取及Unigene的组装

灰树花子实体RNA 经过NanoDrop定量后，获得浓度为381.1ng／μL 的总RNA，260／280为2.12.完整性及28S∶18S（图1）均符合转录组测序质量要求，进入下一步实验.利用Trinity对RNA－seq的原始reads数据进行拼接，获得的contig进一步拼接获得Unigene.最终，我们获得63 137个Unigene，资料组总长度155 171 094nt，最长Unigene 20 996nt，最短Unigene 201nt，平均组装长度为2 457.689nt，（G＋C）／（A＋T＋G＋C）为0.522，N50为3 405nt，N90为1 390nt.

图1 灰树花子实体RNA 电泳检测Fig.1 The electrophoresis detection of maitake RNA

图2 Unigene长度分布统计Fig.2 Length distribution of maitake Unigene

从Unigene的长度分布来看，Unigene主要集中在1 500～10 000nt之间（图2）.在2 000～3 000nt之间的Unigene数量最多为13 135个，占总数的20.8%；1 500～2 000nt之间Unigene数为8 979，占总数的14.2%；3 000～4 000nt之间Unigene数为7 429，占11.76%.

2.2 Unigene的NR 数据库比对分析

将Unigene序列和NR 数据库进行Blast（参数为1.0×10－5）比对分析，能比对上的Unigene个数为46 640 个，占总的Unigene数目的百分比为73.87%.按物种分布统计，能比对上的物种所对应的Unigene数目最多的是变色栓菌，比对上的Unigene数为14 593 个，占31.29%，其次为木质素降解菌，比对上的Unigene数为9 220个，占19.77%（表1）.

表1 灰树花Unigene的NR 数据库比对分析Tab.1 Blast results of maitake Unigene via NR

2.3 Unigene的GO 分类

对Unigene进行GO 注释和GO 功能分类.最终（图3），在细胞组成（Cellular component）、分子功能（Molecular function）、生物过程（Biological process）3 个本体中，分别获得9，12，14个注释条目（Class）数.注释到的Unigene数量最多的是生物过程本体，注释到的Unigene数最少的是细胞成分本体.

图3 灰树花Unigene的GO 分类Fig.3 Gene ontology classifications of maitake Unigene

2.4 Unigene的COG 分类

将所测物种的最佳蛋白序列提交到NCBI上（COG－4873PSSMs，E－value 0.01，Maximum number of hits 500），得到与Unigene编号相对应的COG 编号，统计COG 每个类别Unigene数目.从基因数量分布来看（图4），分类最多的是功能预测蛋白，其他较多的分类与基因的功能与糖转运与代谢、脂质转运与代谢、氨基酸转运和代谢、翻译后修饰、蛋白转换、分子伴侣有关.

图4 灰树花Unigene的COG 分类Fig.4 COG functional classifications of maitake Unigene

2.5 Unigene的代谢通路分析

KEGG 数据库（http：∥www.genome.jp／kegg／）可系统分析其基因在细胞中的代谢通路及功能.通过KEGG 注释，共有27 472 个Unigene被注释，被Unigene注释到的代谢通路有239个，注释最多的代谢通路与生化代谢、微生物代谢、次生代谢产物生物合成、嘌呤代谢、RNA 运输等有关（表2，注释到基因数前10位代谢通路）.

2.6 Unigene的SSR 信息分析

表2 KEGG 注释比例最多的前10位代谢通路Tab.2 The top 10pathways annotated by KEGG

从灰树花63 137个Unigene中查找到5 294个SSR位点，占Unigene总数的比例为8.38%（表3）.SSR 存在较为丰富的类型，包括单核苷酸重复类型至六核苷酸重复类型均有表现（表4）.其中，单核苷酸重复所占比例最高，达到63.4%，其次是三核苷酸重复，为24.44%，双核苷酸重复，比例为8.76%；比例最低的是六核苷酸重复，仅为0.11%，四核苷酸重复和五核苷酸重复基本相同，分别为1.81%和1.42%.在检出的SSR 中，出现频率最高的重复基元为A／T（占56.10%），其次为CCG／CGG（6.18%），AG／CT（3.29%），ACAGG／CCTGT（1.28%），AATG／ATTC（0.62%），AACAGC／CTGTTG（0.11%）.上述SSR 特征分析，有助于开展灰树花及其同属物种的基因组差异分析、通用性标记开发和遗传图谱构建研究.

表3 灰树花的SSR 信息分析Tab.3 General statistics of maitake SSR search

表4 灰树花SSR 基序重复类型统计Tab.4 Statistics of repeat type of maitake SSR motif

3 讨论

对灰树花全基因组而言，其转录组序列不含内含子及其它非编码序列，能更高效的挖掘有用信息，在序列分析方面具有性价比高的优势.转录组研究可识别灰树花子实体总转录本的表达，从而了解灰树花子实体完整的基因表达谱，为灰树花具有生物功能的“蛋白质组”研究的必然纽带.基于灰树花总转录水平的研究是目前研究最广泛的调控研究方式［11］.

本研究构建了第一个高质量灰树花cDNA 文库，首次采用了Illumina高通量测序技术对文库进行了测序，序列拼接后得到63 137个Unigene.将Unigene序列和NR 数据库进行Blast比对分析，能比对上的Unigene占总Unigene数的73.87%.COG 分类显示，最多一类基因是功能预测蛋白，其他较多基因功能与糖转运与代谢、脂质转运与代谢、氨基酸转运和代谢、翻译后修饰、蛋白转换、分子伴侣有关.该结果显示，利用高通量测序不仅可监测灰树花特定时间段的基因表达，更可大量挖掘其代谢过程中的重要基因.

根据KEGG 代谢通路数据库，对所得灰树花转录组的Unigene进行代谢通路注释和预测，共有27 472个Unigene被注释，被Unigene注释到的代谢通路有239个，该类基因参与了灰树花子实体体内的生化合成和次生产物代谢，研究该类基因，将为开展灰树花基因克隆、功能基因验证等分子手段提供生物信息学基础.

本次试验通过SSR 位点查找共发现5 294个SSR 位点，利用SSR 位点，筛选目的条带清晰、多态性好的引物，从而为分析灰树花群体遗传多样性、构建灰树花遗传连锁图谱、进行灰树花的分子育种奠定基础.

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