NaCl盐度对氨氧化细菌活性的影响及动力学特性

张宇坤，王淑莹，董怡君，顾升波，彭永臻

（北京工业大学北京市水质科学与水环境恢复工程重点实验室，北京100124）

NaCl盐度对氨氧化细菌活性的影响及动力学特性

张宇坤，王淑莹*，董怡君，顾升波，彭永臻

（北京工业大学北京市水质科学与水环境恢复工程重点实验室，北京100124）

含盐废水的硝化过程常常出现亚硝酸盐积累，NaCl盐度对氨氧化菌（AOB）活性的影响与动力学特性并不清楚.采用高浓度氨氮污水富集培养AOB，并成功实现短程硝化.对富含AOB的污泥进行荧光原位杂交技术（FISH）分析表明AOB占细菌总数比例为（55±7）%.污泥的最大比氨氧化速率为（0.92±0.13）gN/（gVSS·d）.用此污泥考察了NaCl盐度对AOB活性的影响，并测定了10g/L时AOB的动力学参数（KNH3、Ko）.试验结果表明，与盐度为0g/L时的AOB活性相比，盐度为15g/L时的AOB活性降低了37%；盐度为30g/L时降低了85%.盐度为10g/L时，AOB的最大比氨氧化速率为（0.62 ± 0.03）gN/（gVSS·d），底物半饱和常数KNH3值为（7.62 ± 0.13）mg/L，氧的半饱和常数Ko值为（0.39 ± 0.04）mg/L，其中KNH3测定值高于ASM2模型推荐值.NaCl盐度对AOB的抑制降低了最大比氨氧化速率，对底物（NH4+-N）传递存在影响.

活性；废水；动力学；氨氧化细菌；盐度

随着淡水资源的紧缺，部分沿海地区采用海水替代城市生活用水（海水冲厕，消防等）［1-2］，此外，一些人类生产活动（海产品加工废水，蔬菜腌制等）也会带来大量的无机盐［3-4］.含无机盐的废水与市政污水混合后进入城市污水处理厂，会对活性污泥产生毒害作用［5］，严重影响污水处理厂的正常运行.海水利用产生的污水经市政管网最终流入污水处理厂，水量约占污水处理总量的30%，含盐生活污水的盐度一般不超过10g/L［6-7］.

硝化过程作为污水生物处理的重要组成部分，含盐废水的硝化过程活性（最大比氨氧化速率与盐度为0g/L时最大比氨氧化速率的比值）低于普通活性污泥法［8-10］.微生物实验表明［7］，氨氧化细菌（AOB）的存活率（采用most probably number （MPN）计数法［11］）随盐度增高而减小.随着盐度的升高，细胞的渗透压增大，不利于细胞内底物、氧的传递［12］，这可能是含盐废水硝化过程效率低下的原因之一.底物-N）半饱和常数（KNH3）和氧的半饱和常数（Ko）是表征AOB的氨氮、氧的传递能力的动力学参数.ASM2模型中给出了无盐度时AOB的KNH3（1mg/L）， Ko（0.5mg/ L）的参考值［13］.目前，针对NaCl盐度是否会对氨氧化过程中氨氮、氧的传递能力（KNH3，Ko）产生影响还鲜见报道.现有的研究在测定硝化菌群的KNH3，Ko值时常采用异养菌为主的活性污泥［14-16］，Manser［14］等测定了普通活性污泥中AOB的KNH3= （0.14 ± 0.1）mg/L， Ko= （0.79 ± 0.08）mg/L；顾升波［16］测定了短程硝化污泥中AOB的Ko= 0.26mg/L，污泥中较低的硝化菌群比例（AOB占全菌比例约3.5～5%）［15-16］，降低了硝化菌群动力学参数测定结果的可靠性；对AOB进行富集培养［17-18］有利于提高AOB占全菌比例，本研究以富含AOB的活性污泥（AOB占全菌比例大于50%）为研究对象，减少了异养菌等对动力学测定的影响，可获得更加准确的AOB动力学参数.目前研究多集中于盐度对混合菌群的COD氧化能力、硝化效果的影响，关于盐度对AOB的活性影响及动力学还未见报道.本试验拟采用序批式反应器（SBR）装置富集培养AOB，以富含AOB的活性污泥为研究对象，检测NaCl盐度对AOB活性的影响，并测定盐度为10g/L时AOB的最大比氨氧化速率KNH3值，Ko值，分析NaCl盐度对AOB活性及动力学参数的影响，为污水处理厂高效处理含盐废水提供技术支持.

1 材料与方法

1.1 氨氧化细菌富集装置及运行方式

采用有效容积为10L的SBR装置富集AOB.其中有效容积均为8L，每周期进水2L，排水比为25%；通过温控装置控制温度在22～25℃；溶解氧（DO）控制在2mg/L以上.在每周期开始时和120min时开启蠕动泵，投加1mol/L的NaOH将 SBR装置pH值调节到7.5～8.0；每周期运行360min：进水（12min），曝气（300min），沉淀30min，排水12min，闲置6min；污泥龄约为15d.经过422d富集培养，最大比氨氧化速率可达0.92gN（gVSS·d）.

1.2 试验用水水质

对于AOB的富集，人工配置污水采用Vadivelu等［18］的配方，采用NH4HCO3（2000mgN/ L）作为无机碳源和氮源；配制污水均添加痕量元素［18］（2mL/L）.配水组成见表1，所有的配水试验用水都经过灭菌后再连入反应器；如前所述，耐盐污泥系统常采用盐度10g/L作为污泥驯化的上限［6-7］，因此在测定含盐废水AOB的动力学参数时，盐度（NaCl）均设定为10g/L.

表1 人工配制污水水质情况Table 1 Characteristic of artificial wastewater

1.3 批次试验

1.3.1 NaCl盐度对AOB氨氧化活性的影响 NaCl盐度对AOB氨氧化活性影响的批次试验共6个批次，盐度（NaCl）分别设定为：0，5，10，15，20，30g/L，每个批次包含3组平行试验.试验开始前向500mL批次试验瓶内投加碳酸氢铵溶液，氨氮初始浓度为50mg/L.试验过程中通过投加HCl和NaOH控制pH值为7.2±0.1；控制DO＞4mg/L.批次试验时间为30min，水样经Millipore 0.45μm滤膜过滤后检测水样中-N浓度，混合液悬浮固体浓度（MLSS）约为922mg/L，混合液挥发性悬浮固体浓度（MLVSS）约为768mg/L.

式中：q为比氨氮氧化速率，mg/（gVSS·h）；qmax为最大比氨氮氧化速率，mg/（gVSS·h）；SNH3为氨氮浓度，mg/L；KNH3为底物-N）半饱和常数， mg/L.

1.3.3 氧的半饱和常数的测定 批次试验共进行12个批次，每个批次设定不同的DO浓度（0.3～9mg/L）；批次试验中均提供过量的（远大于KNH3值）底物-N）：初始-N浓度为30mg/L，每隔5～10min其他条件与底物-N）半饱和常数试验条件相同.Ko值采用式（2）拟合DO浓度--氨氧化菌活性进行检测［19］，

式中：So为溶解氧（DO）浓度， mg/L；Ko为氧的半饱和常数， mg/L.

1.4 检测指标及分析方法

氨氮、亚硝态氮、硝态氮、MLSS、MLVSS均采用标准方法测定［20］.荧光原位杂交技术（FISH）采用Amann［21］的操作方法进行，采用4% PFA， 4℃条件下对污泥样品固定120～180min.对固定后的污泥样品超声分散1min，将样品滴加在明胶包被过的载玻片上，干燥后先后浸泡于50%、80%和98%的乙醇溶液中脱水3min. 杂交缓冲液组成包括0.9mol/L NaCl、20mmol/L Tris/HCl，0.01% SDS和甲酰胺（甲酰胺FA浓度见表2，pH值为7.2）.将荧光标记的寡核苷酸探针溶解于杂交缓冲液中，在46℃下与污泥样品杂交120min.采用的寡核苷酸探针列于表2.杂交结束后，采用洗脱缓冲液在48℃下洗脱20min.在干燥后的样品上滴加抗荧光衰减液，对每个污泥样品随机拍摄20～25张照片（OLYMPUS BX61荧光显微镜），并采用Image-pro plus 6.0Software®进行计数分析；污泥粒径分布、污泥比表面积检测采用Beun［22］的操作方法.

表2 所用寡核苷酸探针碱基序列Table 2 Oligonucleotide probes used in this study

2 结果与讨论

2.1 AOB富集装置典型周期污染物变化情况及污泥分析

由图1可见，在0～180min氨氮逐渐下降，约170mg/L氨氮被氧化.最大比氨氧化速率为（0.92± 0.13）gN/（gVSS·d），这显示AOB富集装置具有很高的氨氧化活性；同时，亚硝态氮也逐渐增加，0～180min共增加了163mg/L，没有检测到硝态氮.这说明系统中NOB含量较少或活性不高，成功实现了短程硝化，有利于提高AOB占细菌总数的比例.值得注意的是，在180～300min时系统氨氮浓度仍然较高（530mg/L），且氨氮停止下降，这可能是因为此时的pH值很低（约5.9），生成的亚硝态氮以游离亚硝酸（FNA最大值约为0.5mg HNO2-N/L）形式存在，抑制了氨氧化过程［17］.由图1b可见，系统温度稳定在（26±1）℃，pH值在氨氧化过程一直在下降，这是由于氨氧化过程释放H+.在曝气120min时用1mol/L的NaOH将反应器pH值调节到7.5～8.0.当pH值在5.9左右时（第180min）pH值不再下降，这可能是由于氨氧化过程受到FNA抑制［17］，停止释放H+；DO在140min左右出现突跃点，此时氨氧化速率变小（图1a），需氧量下降.对富含AOB的活性污泥进行FISH检测（图2），结果显示AOB占细菌总数比例为（55±7）%，Nitrobacer占细菌总数比例（4±1）%，未检测到Nitrospira.对AOB富集装置内污泥（第422d）的粒度分布情况进行分析（图3），可以看出污泥的粒径主要分布在50～400μm之间，其污泥平均粒径为163μm，与顾升波［16］培养的AOB污泥粒径相差不大，但大于Blackburne等［19］富集的NOB污泥粒径.同时测得该污泥比表面积为0.0577m2/g.

图1 SBR典型周期（第422d）中氨氮，亚硝态氮，硝态氮浓度及参数变化情况Fig.1 Profile of ammonia， nitrite， nitrate and parameters in typical SBR cycle （the 422d）

2.2 NaCl盐度对AOB氨氧化活性的影响

图4显示了NaCl盐度对AOB的氨氧化活性（最大比氨氧化速率与盐度为0g/L时最大比氨氧化速率的比值）的影响.AOB的氨氧化速率随盐度（0～30g/L）的增大而逐渐减小（图4a），盐度为0g/L时AOB的最大比氨氧化速率最大，为0.92gN/ （gVSS·d）；盐度为10g/L时AOB的活性相对0g/L时降低27%；当盐度增加为30g/L时，AOB的活性降低了85%.对盐度与AOB活性关系进行线性拟合，结果显示两者线性关系良好（图4b），q/qmax= -2.64X + 100， R2= 0.98.这显示NaCl盐度对AOB的活性存在重要影响，盐度的升高会严重抑制AOB的氨氧化活性，这与以往的研究结果一致［2，6］.Omar等［12］认为高盐污水提高了胞内渗透压，限制了细胞的物质传输，这可能是含盐废水氨氧化活性下降的原因之一.

图2 富含AOB系统FISH分析（第422d）Fig.2 The FISH analysis of activated sludge in AOB enrichment system （422d）

图3 富含AOB系统污泥的粒度分布Fig.3 Volumetric floc size distributions of activated sludge in AOB enrichment system

由图5可见，随着氨氮浓度的增加，AOB的活性（比氨氧化速率与最大比氨氧化速率的比值）也逐渐增加. 采用式（1）对底物与AOB活性进行拟合［19］， q/qmax= 100%×SNH3/（7.62+SNH3），最大比氨氧化速率为（0.62 ± 0.03）gN/（gVSS·d）， KNH3=（7.62 ± 0.13）mg/L； R2= 0.95. ASM2模型［13］中AOB的KNH3推荐值为1mg/L，本试验测得的KNH3值高于ASM2模型推荐值.较高的KNH3值意味着随着氨氮浓度的降低，最大比氨氧化速率会大幅下降，硝化效率降低，氨氮氧化过程难以进行到底.为了实现含盐废水氨氮的达标排放，需要更长的曝气时间.含盐废水提高了氨氧化菌的细胞渗透压［12］进而对底物的传递产生抑制，底物半饱和常数KNH3值也随之升高；另一方面，较大的污泥粒径也会提高硝化菌群的KNH3值［19］.对污泥进行耐盐驯化可能有助于提高含盐废水的硝化效率［7］.

图4 NaCl盐度对AOB氨氧化活性的影响Fig.4 Effect of NaCl salinity on activity of AOB

2.4 氧的半饱和常数的测定

由图6可见，盐度为10g/L时，随着DO浓度的增加，AOB的活性也逐渐增强.当DO浓度增加到1.3mg/L附近， AOB活性达到最大值，此后的AOB活性几乎都在最大值上下波动.AOB活性与DO浓度关系拟合相关性良好（R2=0.96）.最大比氨氧化速率为0.62gN/（gVSS·d）； Ko=（0.39± 0.04）mg/L.ASM2模型［13］中AOB的Ko推荐值为0.5mg/L，与本试验Ko测定值接近.与盐度为0g/L相比，NaCl盐度（10g/L）对AOB的氧的半饱和常数影响不大.

图5 AOB活性随着氨氮浓度的变化规律（盐度为10g/L）Fig.5 The variation of activity of enrichment AOB with ammonia

图6 AOB活性随DO浓度的变化规律（盐度为10g/L）Fig.6 The variation of activity of enrichment AOB with DO

3 结论

3.1 AOB富集装置的污泥经过422d的富集培养，AOB成为优势菌种，FISH分析结果显示AOB占细菌总数比例为（55±7）%.污泥平均粒径为163μm.

3.2 盐度为0g/L时AOB的最大比氨氧化速率为0.92gN/（gVSS·d）.盐度为5g/L时，AOB的活性相对0g/L时降低了17%；盐度增加到20g/L时，AOB的活性降低了62%.

3.3 盐度为10g/L时AOB的最大比氨氧化速率为（0.62±0.03）gN/（gVSS·d），底物（NH4+-N）半饱和常数KNH3值为（7.62±0.13）mg/L，氧的半饱和常数Ko值为（0.39±0.04）mg/L.

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致谢：感谢刘丽在论文修订、试验方面给予的帮助和支持.

Effect of NaCl salinity on activity of ammonia-oxidizing bacteria and kinetic characterization.

ZHANG Yu-kun，WANG Shu-ying*， DONG Yi-jun， GU Sheng-bo， PENG Yong-zhen
（Key Laboratory of Beijing for Water Quality Science and Water Environmental Recovery Engineering， Beijing University of Technology， Beijing 100124， China）

China Environmental Science， 2015，35（2）：465～470

Nitrite accumulation was always observed in the saline wastewater nitrification process， but the effect of NaCl salinity on ammonia-oxidizing bacteria （AOB） activity and kinetic characterization has not been clear. In this study， AOB was enriched in a lab-scale SBR system with high concentration of ammonium wastewater， and the partial nitrification was successfully achieved. The fluorescence in situ hybridization （FISH） analysis showed that AOB accounted for （55 ± 7）% of total bacteria. The maximum specific ammonia oxidation rate was （0.92 ± 0.13）gN/（gVSS·d）. The effect of NaCl salinity on AOB activity was investigated using this mixed culture. The kinetic parameters of AOB （KNH3、Ko） were also measured under NaCl salinity of 10g/L. Results showed that compared with NaCl salinity 0g/L， the activity of AOB decreased 37% under NaCl salinity of 15g/L and decreased 85% under NaCl salinity of 30g/L. When salinity was 10g/L，the maximum ammonia oxidation rate was （0.62 ± 0.03）gN（gVSS·d）， the half-saturation constant for ammonia （KNH3） was（7.62±0.13）mg/L， the half-saturation constant for oxygen （Ko） was （0.39±0.04）mg/L. The KNH3value was higher than recommended value of ASM2model. NaCl salinity could reduce maximum specific ammonia oxidation rate， and also affects the substrate （ammonia） affinity of AOB.

activity；wastewater；kinetics；ammonia-oxidising bacteria；salinity

X703.1

A

1000-6923（2015）02-0465-06

张宇坤（1987-），男，黑龙江哈尔滨人，北京工业大学博士

2014-02-07

高等学校博士学科点专项科研基金（20111103130002）；北京市科委科技创新平台项目

* 责任作者， 教授， wsy@bjut.edu.cn

研究生，主要从事污水生物处理方面的研究.