正交设计法优化补肾通痹颗粒提取工艺

谢明艳

（衡阳市中医医院药剂科，湖南 衡阳 421001）

风湿病是一种发病机制相当复杂的疾病，临床上非常常见，且难完全治愈[1]。目前，临床上治疗该疾病的药物主要是糖皮质激素类或甾体抗炎药物，治疗效果不好而且存在较大的不良反应[2-3]。补肾通痹颗粒是我院临床经过多年实践，总结归纳得到的对于治疗风湿有确切疗效的处方，经过制药设备的提取和浓缩，加入辅料制成易于患者服用的颗粒剂，在本院多年的使用期间对患者疾病的治愈起到很大的作用。为了进一步保证药物的质量和确切的治疗效果，本研究通过分析处方组成，利用高相液相分析和薄层色谱法对处方主要成分进行分析，以确定最佳的提取工艺，现将具体结果报道如下。

1 处方提取

补肾通痹颗粒处方为：首乌藤60 g，鸡血藤60 g，鹿衔草35 g，丹参35 g，延胡索（醋炙）35 g，桑寄生30 g，骨碎补（烫）30 g，肉苁蓉30 g，地黄30 g，知母20 g，甘草15 g，熟地黄15 g。将处方中的各味中药按照正交设计表中各因素中的水平进行加热和提取，在各个提取液中加入沉淀剂至完全陈定后过滤，取滤液，使用超纯水对滤器进行冲洗，将滤液和冲洗液进行合并，在真空条件下进行浓缩，至密度为1∶1。

2 材料与仪器

处方中各饮片均符合2010版《中国药典》中的规定。将槲皮素、延胡索乙素和原儿茶醛作为对照品（中国药品生物制品检定所提供）；色谱仪为岛津LC-20A高效液相色谱仪（LC-20A泵，Alltech3300型蒸发光散射检测器）；其余试剂均为分析纯，水是超纯水。

3 方法和结果

3.1 丹参、延胡索、桑寄生提取工艺考察：使用槲皮素、原儿茶醛、延胡索乙素、丹参酮的薄层鉴别作为指标，分别使用醇提法和水提法来考察3味处方中主要成分的药材的提取效率。

3.1.1 水提法：取35 g延胡索（醋炙）、35 g丹参和30 g桑寄生在圆底烧瓶中，加入10倍水进行加热回流，1.5 h后进行过滤，取药渣加入8倍水进行加热回流，1 h后过滤，将滤液合并浓缩至50 mL备用。

3.1.2 醇提法：取35 g延胡索（醋炙）、35 g丹参和30 g桑寄生在圆底烧瓶中，加入10倍50%乙醇进行加热回流，1.5 h后进行过滤，取药渣加入8倍50%乙醇进行加热回流，1 h后过滤，将滤液合并浓缩至50 mL备用。

3.1.3 鉴别：取20 mL本品，研细后加入20 mL甲醇，进行超声处理，30 min后进行过滤，去滤液进行浓缩，浓缩至20 mL后在进行20 min超声处理，加乙酸乙酯摇动提取（2次，30 毫升/次），将2次乙酸乙酯液合并后蒸干，取残渣加入1 mL乙酸乙酯液作为供试品溶液。再取对照品槲皮素加入乙酸乙酯后制成0.5mg/mL溶液，作为对照品溶液。进行薄层色谱法试验（2010版《中国药典一部附录VB》）：使用0.5%氢氧化钠溶液制备硅胶G薄层板，吸取上述2种溶液各10 μL分别点在同一个薄层板上，使用甲苯-乙酸乙酯-甲酸（比例为5∶4∶1）作为展开剂，进行展开、取出和晾干，再喷洒5%三氯化铝乙醇溶液，放置在365 nm紫光灯下进行检视。供试品色谱中在和对照品色谱相应的位置上会有相同颜色的荧光斑点显示。

3.2 醇提工艺条件选择：本方中延胡索乙素的含量测定方法选择高效液相色谱法。

3.2.1 正交试验设计：考察原料粒度大小、提取时间、溶媒量等因素对延胡索乙素、原儿茶醛提取含量以及药物有效成分提取的影响，因此在实施正交试验时选择不同浓缩方式也作为一个因素[4-6]，具体见表1。

表1 正交试验工艺因素水平

3.2.2 高效液相色谱法色谱条件：甲醇和0.1%磷酸（PH使用三乙胺调整至6.0）以60∶40比例作为流动相，使用C18柱，检测波长为280 nm。按照延胡索乙素峰计算理论板数，不低于2000。

3.2.3 制备对照品溶液：取适量对照品延胡索乙素，加甲醇制成0.04 mg/mL溶液。

3.2.4 制备供试品溶液：取5 mL延胡索纯提液，进行精密称定后放置在离心管中，加入20 mL甲醇，进行超声处理（2次，20分钟/次），将滤液合并蒸干后，取残渣加10 mL水溶解，加入5 mL浓氨水，使用乙醚进行萃取（3次，20毫升/次），取3次萃取后的乙醚液进行合并和挥干后取残渣，加甲醇5 mL溶解后即为供试品溶液。

3.2.5 测定方法：分别取20 μL对照品和供试品溶液，注入液相色谱后进行测定，测定结果见表2。

表2 正交试验结果

根据表2可知，最佳提取工艺为A1B2C3D1。将延胡索乙素提取效率作为指标，提取效率越高，效果也越好，可以作为工艺选择指标[7-8]。根据试验结果分析可知，中等粒度的延胡索乙素，50%乙醇和8倍溶剂量，并进行2次提取，在减压高温条件下进行浓缩的提取方案为最佳方案。按照该方案进行验证，结果显示延胡索乙素的提取效率较好，且进行薄层鉴别可见斑点明显。表明该提取工艺合理可行。

4 讨 论

该补肾通痹颗粒适用于腰酸软、风湿痹痛、关节痹痛、筋骨无力等病症的治疗，处方中的首乌藤、地黄和桑寄生作为君药，具有养血活络、祛风湿、强筋骨和补肝肾的作用；延胡索和丹参为臣药，作用为活血通络；甘草则对诸药进行调和，诸药联用具有祛风湿、益肾健骨、强腰膝、增强免疫和强健体质的作用[9-10]。辅助合理稳定的提取工艺可以保证药物作用最大化地发挥。

本研究中使用延胡索乙素提取效率作为指标，提取效率越高，效果也越好。根据试验结果分析可知，中等粒度的延胡索乙素，50%乙醇和8倍溶剂量，并进行2次提取，在减压高温条件下进行浓缩的提取方案为最佳方案。

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