泌尿生殖道支原体感染检测及药敏分析进展

2015-11-05 02:21毛得斌
右江医学 2015年5期

毛得斌

【关键词】 泌尿生殖道;支原体感染检测;药敏分析

中图分类号:R518.5 文献标识码:A DOI:10.3969/j.issn.10031383.2015.05.029

近年随着时代的变迁,泌尿生殖道支原体感染发病率呈上升趋势,现已成为临床上最常见的性传播疾病之一,其传播速度快、感染性极强,影响了人们的健康及正常生活状态[1]。近年来在治疗泌尿生殖支原体感染过程中,由于抗生素的不合理使用,临床分离株耐药性日益严重,抗菌药物治疗效果下降,经验用药治疗失败病例不断增多。本文从泌尿生殖道支原体感染的检测和药敏分析进行综述如下。

1 泌尿生殖道支原体的概念及其临床意义

支原体是目前最简单的原核生物,多以球体的形式存在,体内依然有DNA、RNA和蛋白质等基础物质。其中在特定环境下,解脲支原体(Uu)、人型支原体(Mh)以及生殖支原体(Mg)可导致非特异性尿道炎(NGU)、慢性前列腺炎、附睾炎等疾病[2]。其释放的侵袭性酶和毒性产物有可能成为致病物质[3]。此类患者大多年龄在22~55岁,其感染人群更集中在性生活比较活跃的年轻人,也表明了此病在不洁性行为传播比较频繁[4,5]。以上表明,泌尿生殖道支原体感染检测对性病防治及优生保健工作有重要的指导意义。

2 泌尿生殖道支原体感染的检测方法

泌尿生殖系统感染的检测方法有经典的液体培养法、固体培养法,但随着微生物学、免疫学、分子生物学的发展,像金标免疫斑点法、聚合酶链式反应(PCR)、荧光定量PCR(FQPCR)、连接酶链反应、荧光核酸恒温扩增技术(SAT)、恒温扩增试纸条技术(LAMP)、反向斑点杂交技术(RDB)等新手段让泌尿生殖道支原体感染的检测走进了更深的层次。

2.1 液体培养法

作为WHO推荐诊断NGU的首选方法,液体培养法对实验条件要求不高,而且操作简便、快捷。其最常应用的是鉴定药敏一体化试剂盒法,目前国内很多医院的实验室普遍采用肉汤体液培养法检测泌尿生殖道感染,以肉汤颜色改变来判断结果。其原理是肉汤培养液中含有酚红指示剂和尿素。泌尿生殖道支原体在生长过程中产生的尿素酶分解尿素或精氨酸产碱时,使培养液碱化而变红色,再过24~48 h来判读阳性结果。由于泌尿生殖道标本菌群复杂,混杂的肠杆菌、真菌(白色念珠菌)及某些葡萄球菌也能分解尿素,如果不能被液体中抑制剂抑制,在其倒置繁殖过程中分解尿素可导致培养液变红,从而引起检测的假阳性[6]。有研究发现即使培养基中加入青霉素以抑制细菌生长,但随着细菌耐药率的增高,仍有部分耐药菌在培养液中大量繁殖[7];此外当不产脲酶真菌浓度高时,支原体与真菌混合感染培养液明显浑浊,可能造成假阴性。因此要提高泌尿生殖支原体检测的准确率,降低假阳性率,不仅培养基中抗生素的配制要合理,而且培养液中要选择有效抑制真菌的抑制剂,控制假阴性的产生。

2.2 固体培养法

固体培养法检出率较低,不能用于药敏试验,而且检测成本相对昂贵。但由于其特异性高,可作为确诊的标准。该法能形成“油煎蛋”样特征菌落和经典的棕褐色颗粒菌落,显示支原体生长。由于固体培养过程中需要CO2,药敏试验需要培养后再转种,导致使用成本高、耗时长,制约了其在临床上的广泛应用。上海同济大学程琼等学者[8]研制的一种固体培养基中增加血清含量,添加含有多胨等基础营养成分和0.9%琼脂,添加促进支原体生长的细胞培养液(10%DMEM);除传统的青霉素外,抑菌剂还添加了非抗生素类抑菌成分;操作中将150 μL(5~6滴)的洗脱液在新型固体培养基上均匀平铺,标记好后置于CO2培养箱中孵育,保持培养箱37℃恒温,每24 h、48 h各观察一次,培养48 h后,用低倍镜进行观察。周良佳等[9]研究发现该新型固体培养基的优点在于灵敏度高,选择性强,支原体菌落出现早,检测限低,微生物诊断的直接证据是通过显微镜观察支原体特有的菌落形态,在传统培养基的基础上新型固体培养基增加血清含量,添加了促进支原体生长的细胞培养液(10%DMEM),使培养周期缩短。由于支原体菌落较小而无法用肉眼看到,所以需要用显微镜等观测仪器进行观察,且杂菌具有较高的污染率,有时会影响镜下观察效果导致假阴性判断,因此应在防治真菌污染方面做进一步的分析研究。

2.3 金标免疫斑点法

又称为ELISA法或金标法,根据抗原抗体反应来检测特异性结合试剂的原理进行支原体检测。临床上对Uu常采用金标准方法,用于检测Uu抗原的金标快速检测试剂盒已经商品化,使得Uu感染患者的抗血清抗体能快捷检测出来,可作为人群支原体感染的医疗检测或筛选方法。由于正常人也存在低滴度的抗体水平,根据抗体测定法,将无法对患者是现症感染还是既往感染做出有效的判断,由于目前国内检测支原体抗体试剂都是定性试剂,这就对支原体抗体试剂的定量化检测有一定的要求。此外,即使患者在接受对症治疗后,血清抗支原体抗体不太可能在短时间内消失很多。因此,使用金标准方法复查治疗后患者的治疗效果,其结果多是阳性,可能会对临床诊断产生误导。

2.4 PCR

Uu感染中被识别的主要抗原为B(multiple banded)抗原,N端包含血清特异的和交叉反应的抗原决定簇[10]。取Uu阳性培养物根据MB基因序列设计的引物可进行PCR分型鉴定。由于PCR不受细菌存活与否的限制,且具有高敏感性及特异性,近几年来被广泛用于临床标本Uu的检测,使那些不能培养或很难培养的微生物也得到快速诊断,但是较难解决混合感染的问题。由于在实验过程中产物易污染,对实验条件、试剂及操作人员要求较高。

2.5 FQPCR

该法通过荧光探针直接检测病原体的特异DNA判断是否有病原体存在,其灵敏度及特异度高,且快速简便,该技术具有荧光技术和闭管检测以及自动分析结果功能,使得PCR扩增产物的污染能定量,具有极高的使用价值。PCR扩增Ct的靶基因主要有MOMP、隐蔽性质粒基因和rRNA基因三种,隐蔽性质粒基因敏感性最高。Uu的16sRNA、脲酶基因、MB抗原基因为Uu扩增的靶基因[11]。张中华等[12]采用三种方法检测泌尿生殖道支原体,其中FQPCR法灵敏度高达95.3%,ROC曲线也证实其诊断价值高于另外的两种检测方法。实验研究阶段的FQPCR现已进入临床应用阶段,逐渐成为临床快速诊断的重要技术。endprint

2.6 SAT

该技术核酸扩增在42℃下进行,直接以病原体特异性RNA为扩增靶标,以扩增产物RNA为检测靶标,15~30分钟即可将模板扩增109倍,其检测灵敏度和准确性远高于其他核酸检测技术,SAT采用MMLV逆转录酶和T7RNA多聚酶进行核酸扩增,反应抑制物有效减少,假阴性结果也有效下降。扩增产物的污染是核酸检测的控制难点。SAT采用实时荧光闭管检测,扩增产物为RNA,其在环境中易降解,有效控制污染,从而使检测结果大幅提高。郑雅萍等[13]研究发现,在初诊、未经治疗的患者病原体检测中SAT和FQPCR均可作为判断病原体感染的方法,且作用相当,但FQPCR在治疗过程中,不能排除患者治疗后病灶处已经死亡的病原体残留的DNA对检测结果的影响,而SAT只检测病原体的RNA,而完整的RNA片段只存在于活的病原体中,因此治疗后SAT能有效排除病灶处已经死亡的病原体,有利于临床治疗后的疗效观察及愈后判断,避免过度治疗。

2.7 LAMP

该法是基因扩增技术和免疫层析技术相结合建立的一种新型的检测解脲支原体的方法,具有反应时间短、特异性强、扩增效率高等优点,扩增1~10个拷贝的目的基因能够在1 h内完成,其扩增效率为普通PCR的10~100倍。潘克女等[14]基于环介导恒温扩增技术,根据解脲支原体序列特征设计对引物进行解脲支原体DNA切口酶核酸恒温扩增,扩增过程在一对引物中标记生物素,随着扩增的进行生物素直接引入扩增片段中,扩增结束后产物在密闭装置中进行免疫试纸条显色反应,根据显色卡的颜色判定结果的阴阳性。该技术检测解脲支原体的灵敏度较实时荧光PCR技术要高10倍以上,其特异性与实时荧光PCR技术相当。由于该技术不需要昂贵的特殊仪器,试剂成本低,具有较高的临床应用价值,可在各级医院开展。

2.8 RDB

该技术是利用碱基互补配对原理,特异性探针与扩增的靶基因互补结合,产生一种杂交信号,该技术以其高通量、简便快捷等优点在多种病原体的快速检测中优势明显[15]。石正琪等[16]利用RDB技术结合多重PCR方法可单管扩增并可同时进行多种病原体的检测,该方法通过GenBank获取相关基因序列,并对gD糖蛋白基因和保守序列16SrRNA进行对比,设计2对通用引物,分别扩增HSV1、HSV2的gD糖蛋白基因和Ng、Ct、Mg的16SrRNA基因。该研究证实通用引物的保守性,结合寡核苷酸的特异性和减少多病原体DNA扩增中的引物对数,以达到对病原体的鉴定,同时优化双重PCR和杂交的反应条件,使其具有很好的杂交强度和扩增效率,这种方法具有较高的检出率,能同时检测多种病原体,在病因学筛查和性病的快速诊断等方面意义重大。

3 泌尿生殖道支原体感染的药敏分析

3.1 喹诺酮类药物的作用机理

由于支原体无细胞壁,所以β内酰胺类抑制细胞壁合成的抗菌药对其无效,环丙沙星、氧氟沙星等是Uu、Mh、Mg耐药率较高的抗生素,主要是通过抑制脲支原体属DNA回旋酶来破坏DNA合成,通过干扰脲支原体属生长而达到抗菌的效果[17]。由于喹诺酮类药物的滥用,位于支原体属染色体上的旋转酶基因发生突变,导致支原体DNA旋转酶靶位发生改变,从而使喹诺酮类药物阻断支原体DNA的复制能力降低[18]。

3.2 常见抗生素耐药的原因

由于支原体对影响细胞蛋白合成的抗生素非常敏感,在临床上大多数医疗机构都会选择一些核蛋白体、抑制或影响菌体蛋白合成的抗生素,如四环素、大环内酯类抗生素。有研究证实Uu可以形成生物膜[19~21],可以改变细菌表面细胞膜的通透性,细菌可以采用各种不同方式阻止抗生素进入细菌内部,这样抗生素也不能轻易地渗透到细菌内,因此生物膜的形成使Uu对大环内酯类、喹诺酮类、四环素类等多种常用抗生素的抵抗力也有所增强。

3.3 大环内酯类抗生素药敏分析

目前,国外性传播疾病(STD)治疗指南推荐大环内酯类抗生素作为治疗Mg阳性男性非淋菌性尿道炎的一线方案[22],但有研究证实[23,24],阿奇霉素1 g单剂量疗法对Mg感染的清除率仅为67%~84%,这一现象可能反映阿奇霉素诱导Mg对大环内酯类抗生素耐药性的出现,也提示了人群中已经存在对大环内酯类抗生素耐药性的Mg。交沙霉素等类似药物在人体的胃酸中稳定性极差,很容易被分解,人体胃肠反应较大,对其使用有一定的局限性。

3.4 半合成四环素的药敏分析及作用机理

作为半合成四环素类抗生素,多西环素及米诺环素半衰期长,药品脂溶性很高,容易渗透很多组织液或体液,能在核糖体水平抑制细菌蛋白质合成达到抑菌作用。它是通过阻断氨酰基和核糖核蛋白体的合体,并且让肽链的增长以及合成蛋白质的速度减慢甚至降至零,从而达到抑制细菌成长的作用。

3.5 支原体感染首选药物

国内学者[25,26]研究发现,大环内酯类、喹诺酮类及四环素类抗生素是目前用于泌尿生殖道支原体感染治疗的主要药物,但无论是Uu单一感染还是Uu+MH混合感染,患者对喹诺酮类药物的敏感性绝大部分都低于40%,药敏实验中米诺环素、交沙霉素、多西环素对Uu及Mh敏感率较高,其较高的体外抗菌活性,可用于支原体属感染的首选用药。

综上所述,随着科学技术的进步,泌尿生殖道支原体感染检测水平不断发展。目前各种检测方法中,液体培养法可作为支原体感染的初筛手段,但需要固体培养法作为确诊标准;PCR敏感性高但特异性稍差,易产生假阳性;FQPCR灵敏度及特异度高,但无法同时进行药敏试验;SAT、LAMP、RDB具有高通量、快速简便等特点,是未来快速诊断、鉴定和病因学筛查的重要检查方法。目前在治疗泌尿生殖道支原体感染药物中,喹诺酮类药物敏感性差,已不适合作为经验用药的选择,米诺环素、交沙霉素、多西环素可作为治疗支原体感染的首选药物。医疗机构应认真监测泌尿生殖道支原体药物敏感试验结果,分析其耐药性变化,根据各地区耐药及药敏情况合理使用敏感抗菌药物,对减少和防止耐药菌株的产生和疾病传播具有重要的意义。endprint

参 考 文 献

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(收稿日期:2015-07-17 修回日期:2015-10-25)

(编辑:潘明志)endprint