纤维素降解过程中微生物群落的1166 SS rDNA-PCR--DDGGGGEE分析

赵晓会　刘元金

（1.新乡医学院三全学院，河南 新乡 453000； 2.华兰生物，河南 新乡 453000）

纤维素降解过程中微生物群落的1166 SS rDNA-PCR
--DDGGGGEE分析

赵晓会1刘元金2

（1.新乡医学院三全学院，河南 新乡 453000； 2.华兰生物，河南 新乡 453000）

采用兼性厌氧法筛选出一高效降解纤维素的复合微生物菌群，提取不同培养时间条件下降解菌体系的总DNA，并以其为模板采用PCR-DGGE技术研究了在纤维素降解过程中微生物群落的组成，结果表明，随着培养时间的不同，微生物的群落结构表现出差异。

纤维素降解菌；微生物群落；PCR-DGGE

纤维素是地球上蕴藏量最多的一类可再生资源，广泛存在于绿色植物中［1］。随着石油资源的不断枯竭，人们开始纷纷将目光投入到纤维素的降解上。纤维素分子一般是由D-六环葡萄糖残基通过β-1，4-糖苷键联结而成的链状结构体，其致密的结构，使得纤维素很难被降解［2］。每年有大量的秸秆被焚烧掉，这不仅造成了纤维素的白白浪费，还造成了环境污染［3］。纤维素主要是由能分泌纤维素酶微生物来降解的。在降解效率上，相对于单一菌株，微生物菌群因存在着协调作用而优势更为明显［4］，因此在纤维素降解过程中，菌群结构的动态变化成为当下研究的一个热点。

DGGE即变性梯度凝胶电泳是由Fischer和lerrnan于1979年最先提出的，可检测到一个核苷酸水平的差异，主要用于检测DNA突变。由于DGGE技术可以反映出不可培养菌的存在，因而在分析上更为准确客观。通过电泳条带直接再现群落结构，从而使其成为研究微生物群落遗传多样性和动态性的强有力工具［5］。本实验采用兼性厌氧法筛选出一高效降解纤维素的土壤样品，拟采用DGGE的方法对其纤维素降解过程中菌群结构的动态变化进行分析［6］。

1　材料与方法

1.1材料

复合菌群，筛自实验室所存土壤样品；Ex Taq，DL2000 DNA Marker，dNTP（10 mM each），购自大连宝生物；DNA产物纯化试剂盒，购自北京天根生化有限公司。

复筛（发酵）培养基（g/L）：蛋白胨5，酵母粉1，滤纸5，氯化钠5，碳酸钙2，土壤浸提液10mL（土壤与去离子水以1∶1（质量比）进行混匀，60℃温浴2h，过滤灭菌后备用），调节pH为8.0。

1.2方法

1.2.1复合菌群的获得

将所筛土壤样品接种至复筛液体培养基中，在一个降解周期内每12h取1次样，每次取1mL，共取11次。

1.2.2菌群中总DNA的提取

菌群总DNA具体提取步骤参考文献7，提取后置于-20℃冰箱中保存［7］。

1.2.3PCR扩增

将提取的细菌菌群总DNA作模板，并使用16SV3区通用引物357F：5'-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCCCCG CCC CCC TAC GGG AGG CAG CAG-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3'；518R：5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3'［8］为引物进行PCR扩增。反应体系（50μl）：10×PCR buffer5.0μl、2.5mMdNTPs 2.0μl、Primer 357F（10μM）2.0μl、Primer 518R（10μM）2.0μl、ExTaq（5 U/μL）0.5μl、Template1.0μl、ddH2O37.5μl；退火温度57℃。

1.2.4DGGE实验分析

将获得的16S V3区PCR产物进行DGGE电泳分离。凝胶的制备采用梯度混合装置进行灌胶，其中聚丙烯酰胺浓度为10%，变性剂浓度从上方的40%逐渐递增到下方的50%，待凝胶反应凝固后取10ul的上样缓冲液和5ul样品充分混匀后加入到上样槽中，电泳温度设置为60℃，电压为150V，待上样缓冲液的第二条指示带跑出凝胶时立即停止电泳。取出凝胶，置于溴化乙锭（EB）中染色15-20min，在凝胶成像仪中观察结果。

2　结果与分析

2.116SrDNA V3区扩增PCR结果

图1　16SrDNA V3区PCR产物电泳检测结果

根据V3区的通用引物扩增出来的16S rDNA片断大小大概为220bp，由图1可以看出，各样品在Marker中靠近250bp条带下方都有一条特别明亮的条带，其大小与目的条带相差无几。因此说明经过PCR扩增出16SrDNA V3区片断符合预期，但在拖尾中也可看出含有少量的杂带，需要对V3的特异条带进行切胶纯化后才能进行DGGE分析。

2.2DGGE图谱分析

将上述纯化后PCR产物上样于DGGE凝胶中。从图2中可以看出同一大小的样品经电泳后分出了十多条，其中以标出的七条条带较为清楚。条带1、5、6和7都是随着降解纤维素的时间延长而逐渐减淡，这说明其由最初的优势菌株逐渐变成次要菌株；而条带3和4在整个降解周期中亮度始终明亮，表明其在整个降解过程中地位不变。条带2最为特殊，在降解初期基本没有出现，而从降解中期（60h）开始逐渐变亮，它代表的是后期成长起来的优势菌株。

图2　DGGE图谱Fig.2DGGE fingerprint

3　结论

DGGE电泳充分反映了在降解周期中菌群的变化情况，证明了在纤维素降解不同阶段处于主导地位的菌株是不同的。结合一个降解周期中菌群的变化可以看出：条带1、5、6和7代表的菌株是筛选分泌产纤维素酶的目标菌株，在早期的培养基中纤维素含量较大，在此诱导下，能分泌纤维素酶的菌株会生长较快，反映在DNA水平上就是条带较为明亮。随着纤维素不断被水解成葡萄糖，他们可能会受到葡萄糖效应的抑制而逐渐退化。而另一些可以利用葡萄糖的菌株（条带2代表的菌株）开始成为菌群中的主要成员，其生长又可能进一步改变了培养基的环境，使得其最终在菌群中占了主导地位。条带3和4代表的菌株在整个周期中都大量存在，这说明其既可以发酵纤维素也可以利用葡萄糖，又具有一定的环境耐受性，它们可能是未来筛选降解纤维素最佳菌株。

［1］周晓云.酶技术［M］.北京：石油出版社.1995：224-230.

［2］Gonzalez J，Weiner R.Phylogenetic characterization of amarinebacteriumstrain2-40，adegraderofcomplex polysaccharides［J］.InternationalJournalofSystematic Bacteriology，2000（8）：831-834.

［3］李日强，辛小芸.天然秸秆纤维素分解菌的分离选育［J］.上海环境科学，2002，21（l）：8.

［4］Stephens J H G，Rask H M.Inoculant production and formulation［J］.Field Crops Reseach，2000（65）：249-258.

［5］Salles JF，De Souza FA，Van Elsas JD.Method to assess the diversity of Burkolderia species in environmental［J］. AppliedandEnvironmentalMicrobiology，2002，68（4）：1595-1603.

［6］Gonzalez.J，Weiner R.Phylogenetic characterization of amarinebacteriumstrain2-40，adegraderofcomplex polysaccharides［J］.InternationalJournalofSystematic Bacteriology，2000（8）：831-834.

［7］ZhouJL.Distributionofpolycyclicaromatic hydrocarbons in water and surface sediments from Data Bay［J］. China Environmental Pollution.2003，12（1）：269-281.

［8］吴鑫.DGGE指纹图谱分析太湖富营养化水体中细菌群落结构的变化［D］.上海：上海交通大学，2007.

Analysis of Bacterial Communities during Cellulose Degradation by 16SrDNA-PCR-DGGE

Zhao Xiaohui1Liu Yuanjin2
（1.Sanquan Medical College，Xinxiang Medical University，Xinxiang Henan 453000；2.Hualan Bio-engineering，Xinxiang Henan453000）

A highly effective complex microbial community in cellulose degradation was selected and obtained through afacultative anaerobic.The bacterial DNA was extracted under different cultivation time conditions，and the composition of microbial community in cellulose degradation was studied by PCR-DGGE technology based on the above module.The results showed that there were different structures of microbial community with changing cultivation time.

Cellulasedegradation；Microbial community；PCR-DGGE；

S141.4

A

1003-5168（2015）05-0133-3

2015-4-28

赵晓会（1986.3-），女，硕士，助教，研究方向：微生物学。