葡萄酒泥酵母β-葡聚糖提取工艺条件优化

杨　　婷，祝　　霞，李　　颍，韩舜愈，杨学山（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州7300700；2.甘肃省葡萄与葡萄酒工程学重点实验室，甘肃兰州730070；3.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州730070）

葡萄酒泥酵母β-葡聚糖提取工艺条件优化

杨婷1，2，祝霞1，2，李颍1，2，韩舜愈1，2，杨学山2，3，*
（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州7300700；2.甘肃省葡萄与葡萄酒工程学重点实验室，甘肃兰州730070；3.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州730070）

以诱导自溶的葡萄酒泥酵母细胞壁为试材，在料液比、碱液浓度、浸提时间和浸提温度等单因素实验基础上，采用正交实验优化β-葡聚糖提取最优工艺条件。结果表明，葡萄酒泥酵母β-葡聚糖提取优化的最佳工艺条件为：料液比1∶40（g/mL），NaOH浓度3%，浸提温度80℃，浸提时间1.5 h，在此条件下β-葡聚糖提取率为19.38%。此方法提取率较高且简单易行、成本较低。

葡萄酒泥酵母，β-葡聚糖，碱法，提取

酵母β-葡聚糖位于细胞壁内层，占细胞壁干物质量的40%～60%左右［1-2］。β-葡聚糖具有抗癌、抗肿瘤、抗病毒、降低胆固醇和血脂、增强免疫力等生理活性，是一种良好的生物效应调节剂［3-5］；同时由于其具有高粘性、高持水性和热稳定性等特点［6］，可广泛应用于医药、食品、化妆品、建筑材料等领域［7］。在制备酵母β-葡聚糖过程中，需要大批量发酵培养酵母细胞，既提高了生产成本而且会产生大量废弃物。葡萄酒泥是葡萄酒酿造过程中最主要的副产物，含有大量的酵母细胞［8］。据统计我国每年都会产生约4万吨葡萄酒泥酵母［9］，实际生产中大多作为廉价粗饲料出售或直接排放，不仅浪费了生物资源，同时对环境也造成了很大污染［10］。因此开展葡萄酒泥酵母资源化利用研究，既可降低酵母β-葡聚糖生产原料成本，又能实现较高的经济效益和社会效益［11］。

目前国内外主要利用酵母细胞以酸法、碱法和生物酶法提取酵母β-葡聚糖［12］。由于酵母细胞壁质地坚硬，完全破壁困难导致生物酶法提取率较低，生产成本较高。酸法、碱法尽管得率较高，但产品中杂质过多，纯度不高［13-14］。利用诱导自溶后去除细胞内容物的酵母细胞壁提取β-葡聚糖，可通过纯化原料提高产物纯度［15］。本实验利用诱导自溶后的葡萄酒泥细胞壁为原料，分析料液比、碱液浓度、浸提时间和温度对β-葡聚糖提取的影响，并对其工艺技术进行优化，以期为葡萄酒泥酵母β-葡聚糖开发利用提供技术支持。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

葡萄酒酵母泥甘肃祁连葡萄酒业有限公司；葡萄糖标准品Sigma公司；冰乙酸、异丙醇、无水乙醇、氢氧化钾、氢氧化钠、氯化钠、乙酸钠、蒽酮等均为国产分析纯。

HH-1数显恒温水浴锅上海梅香仪器有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂；TU-1810紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；NSKY-100B恒温培养振荡器上海苏坤实业有限公司；AL204电子天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；PHS-3C pH计上海雷磁；电热鼓风干燥箱上海一恒科学仪器有限公司；L550台式低速离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1提取工艺流程葡萄酒泥→诱导自溶→离心取沉淀（4000 r/min，15 min）→除甘露聚糖→离心取沉淀（4000 r/min，15 min）→碱提→离心取沉淀（4000 r/min，15 min）→有机溶剂处理除脂类→离心取沉淀（4000 r/min，15 min）→干燥（37℃，12 h）→β-葡聚糖含量测定

1.2.2操作要点

1.2.2.1酵母自溶参照本实验室已建立的方法，准确称取4 g葡萄酒泥酵母，加入2%NaCl后溶于pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液，47.5℃诱导自溶33 h，85℃水浴灭酶15 min，4000 r/min离心15 min，取沉淀。

1.2.2.2除甘露聚糖称取自溶后的酵母细胞壁2.5 g，以料液比为1∶12.5混悬，加入3%的KOH溶液，90℃水浴2 h，冷却至室温，用20%的冰乙酸溶液中和至pH7，搅拌10 min，4000 r/min离心15 min，取沉淀。

1.2.2.3β-葡聚糖碱提取按一定的料液比加入NaOH溶液，水浴保温一定时间，4000 r/min离心15 min，取沉淀［16］。

1.2.2.4有机溶剂处理除脂类将沉淀用蒸馏水洗涤2次，加入4%的冰乙酸溶液3 mL，室温下放置2 h，4000 r/min离心15 min，取沉淀，蒸馏水洗涤2次，以料液比为1∶2加入异丙醇，4℃静置12 h，4000 r/min离心15 min，取沉淀。

1.2.3β-葡聚糖含量测定

1.2.3.1标准曲线的绘制参照文献［17］的方法，准确配制葡萄糖质量浓度分别为0、20、40、60、80、100 μg/mL，加入4 mL 0.2%蒽酮试剂，混合均匀后迅速冷却，待各试管加样完成后一起浸于沸水中，加盖，自煮沸起10 min取出，迅速冷却，室温放置10 min。于620 nm波长下比色，记录吸光值，并绘制标准曲线。

1.2.3.2样品制备准确称取20.0 mg固体样品放入水解管中，加入1.5 mL 72%的浓H2SO4，室温下静置3 h，加入蒸馏水使H2SO4的最终浓度为2 mol/L，置于100℃水浴中水解4 h，冷却至室温，调pH至中性。水解液转入100 mL容量瓶定容备用。

1.2.3.3样品测定准确吸取样品溶液1 mL，加入蒽酮试剂4 mL，在620 nm下测吸光值，以标准曲线计算β-葡聚糖含量。

1.2.3.4β-葡聚糖得率的计算

式中：m0-β-葡聚糖质量（g）；c-根据线性回归方程计算得到的样品溶液浓度（μg/mL）；v-样品溶液体积（mL）；m1-样品溶液中β-葡聚糖的质量（g）；m2-粗多糖提取物的质量（g）。

式中：m0-β-葡聚糖质量（g）；m3-酵母细胞壁干重（g）。

1.2.4单因素实验

1.2.4.1料液比对β-葡聚糖提取的影响分别称取5份酵母细胞壁各2.5 g，去除甘露聚糖后，分别以1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）的料液比加入4%的NaOH溶液，置于80℃水浴锅中处理2.5 h，冷却至室温后离心取沉淀，蒸馏水洗涤2次，加入4%的冰乙酸溶液3 mL，室温下处理2 h，离心取沉淀，蒸馏水洗涤2次。向沉淀中加入2倍体积异丙醇，4℃静置12 h，离心取沉淀，加入3 mL无水乙醇溶液洗涤2次。将沉淀置于平皿中，37℃干燥12 h，得粗多糖提取物。计算β-葡聚糖得率，重复3次。

1.2.4.2NaOH浓度对β-葡聚糖提取的影响分别称取5份酵母细胞壁各2.5 g，去除甘露聚糖后，以1∶40（g/mL）的料液比分别加入2%、3%、4%、5%、6%的NaOH溶液，置于80℃水浴锅中处理2.5 h，其余步骤同1.2.4.1。计算β-葡聚糖得率，重复3次。

1.2.4.3浸提温度对β-葡聚糖提取的影响分别称取5份酵母细胞壁各2.5 g，去除甘露聚糖后，以1∶40（g/mL）的料液比加入4%的NaOH溶液，分别置于60、70、80、90、100℃水浴锅中处理2.5 h，其余步骤同1.2.4.1。计算β-葡聚糖得率，重复3次。

1.2.4.4浸提时间对β-葡聚糖提取的影响分别称取5份酵母细胞壁各2.5 g，去除甘露聚糖后，以1∶40（g/mL）的料液比加入4%的NaOH溶液，置于80℃水浴锅中分别处理1.5、2、2.5、3、3.5 h，其余步骤同1.2.4.1。计算β-葡聚糖得率，重复3次。

1.2.5正交实验设计根据单因素实验结果，确定葡萄酒泥酵母中提取β-葡聚糖的正交实验因素和水平，采用L9（34）正交实验设计，因素水平如表1所示。对所选最优组合实验条件提取β-葡聚糖进行验证实验，确定碱法提取β-葡聚糖的最优工艺。

表1　L9（34）正交实验因素水平表Table 1　Factors and levels in L9（34）orthogonal test

1.3统计分析

采用SPSS 18.0软件进行正交实验并对实验结果进行方差分析。

2　结果与分析

2.1标准曲线的制备

通过蒽酮-硫酸法，以β-葡聚糖质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线（图1）。线性回归方程为：y=0.0072x+0.0019（R2=0.9993），符合测定要求。

图1　葡萄糖含量标准曲线Fig.1　The standard curve of various concentration of the glucose

2.2单因素结果与分析

2.2.1料液比对β-葡聚糖提取的影响由图2可知，随着料液比的增加，β-葡聚糖得率逐渐增高，当料液比为1∶40（g/mL）时，β-葡聚糖得率最大，为17.85%。所以选择1∶40（g/mL）料液比为提取β-葡聚糖的较佳料液比。当料液比小于或大于1∶40（g/mL）时，都会使β-葡聚糖提取率下降。出现这一结果的原因是起始原料浓度过高不利于酵母细胞壁分散，与提取液接触不充分影响β-葡聚糖的浸出，造成提取率较低；当料液比大于1∶40（g/mL）时，过量的NaOH会破坏β-葡聚糖结构，导致得率下降［3］。

图2　料液比对β-葡聚糖提取的影响Fig.2　Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of β-glucan

2.2.2NaOH浓度对β-葡聚糖提取的影响由图3可知，NaOH浓度不同时，β-葡聚糖得率不同。当NaOH浓度为4%时，β-葡聚糖得率最大，为17.73%，所以选择4%NaOH浓度为提取β-葡聚糖的较佳NaOH浓度。当NaOH浓度小于4%时，随着碱浓度的增加，β-葡聚糖提取率增加，这是由于β-葡聚糖本身具有一定碱溶性，碱浓度的增加有利于其从细胞壁中溶出［18］；当NaOH大于4%时，得率反而降低，这是由于碱浓度过高，破坏β-葡聚糖的结构，导致β-葡聚糖损失。

图3　NaOH浓度对β-葡聚糖提取的影响Fig.3　Effect of NaOH concentration on the extraction rate of β-glucan

2.2.3浸提温度对β-葡聚糖提取的影响由图4可知，浸提温度为80℃时，β-葡聚糖得率最大，为17.68%，所以选择80℃为提取β-葡聚糖的较佳温度。当温度为60、70℃时，β-葡聚糖提取率比80℃时小，可能是由于碱溶性物质在较低温度下未能充分溶解，致使β-葡聚糖得率较低；当提取温度为90、100℃时β-葡聚糖得率反而随温度的升高降低，可能是由于在高温作用下，部分β-葡聚糖降解为低聚糖，以至β-葡聚糖得率下降。

图4　浸提温度对β-葡聚糖提取的影响Fig.4　Effect of temperature on the extraction rate of β-glucan

图5　浸提时间对β-葡聚糖提取的影响Fig.5　Effect of time on the extraction rate of β-glucan

2.2.4浸提时间对β-葡聚糖提取的影响由图5可知，不同浸提时间下，β-葡聚糖得率也有所差异。当浸提时间为2 h时，β-葡聚糖得率最大，为18.10%，所以选择2 h为提取β-葡聚糖的较佳时间。当浸提时间小于2 h时，碱溶性物质不能完全溶于碱液中，反应不充分，致使β-葡聚糖得率较小；时间过长时，会使β-葡聚糖降解，杂质相应的也被提取出来导致β-葡聚糖得率减小［19］。

2.3正交实验结果与分析

根据单因素实验结果，以β-葡聚糖得率为指标，按L9（34）正交表进行正交实验，结果见表2。由表2实验结果可以得出，影响碱法提取葡萄酒泥酵母β-葡聚糖因素的主次顺序为：NaOH浓度＞浸提时间＞料液比＞浸提温度。提取葡萄酒泥酵母β-葡聚糖的最优组合是A2B1C2D1，即料液比1∶40（g/mL），NaOH浓度3%，浸提温度80℃，浸提时间1.5 h。由表3方差分析可知，NaOH浓度、浸提时间对β-葡聚糖得率影响显著（p＜0.05）。

表2　L9（34）正交实验结果Table 2　Results of L9（34）orthogonal experiments

表3　正交实验方差分析表Table 3　Analysis results of variance

2.4验证实验结果

因正交实验所得最优组合在L9（34）正交实验设计中未出现，需要对所得最优组合进行验证实验。在料液比1∶40（g/mL），NaOH浓度3%，提取温度80℃，提取时间1.5 h条件下提取β-葡聚糖，重复3次取平均值，测得β-葡聚糖得率为19.38%。该得率高于正交实验中各组合得率。因此确定该组合为葡萄酒泥酵母β-葡聚糖提取的最佳工艺参数。

3　结论

利用诱导自溶后的葡萄酒泥酵母细胞壁提取β-葡聚糖，研究了碱法提取β-葡聚糖的最佳关键工艺参数。在单因素实验基础上利用L9（34）正交实验对葡萄酒泥酵母β-葡聚糖提取最佳工艺条件进行了优化。确定的最佳工艺参数为料液比为1∶40（g/mL），NaOH浓度为3%，提取温度为80℃，提取时间为1.5 h，在此条件下所得β-葡聚糖的平均得率达到19.38%。与龚炎杰等［4］利用碱法提取酵母细胞壁β-葡聚糖所得得率10%相比，提高了大约2倍；与黄丹等［20］使用质量浓度6%的NaOH，β-葡聚糖得率8.73%相比，碱用量降低了3%，提取率提高了2.2倍。由此可见，该工艺条件的建立可为利用葡萄酒泥酵母开发β-葡聚糖奠定基础。

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Optimization of extracting processing condition of β-Glucan from wine yeast

YANG Ting1，2，ZHU Xia1，2，LI Ying1，2，HAN Shun-yu1，2，YANG Xue-shan2，3，*
（1.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Gansu Key Lab of Viticulture and Enology，Lanzhou 730070，China；3.College of Life Science&Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

The induced autolytic wine yeast cell wall was used as raw materials to extract β-glucan.On the basis of single factor test including solid-liquid ratio，alkali concentration，extraction time and extraction temperature，the orthogonal test was applied to determine the optimal extraction conditions.The results showed that the optimum conditions of β-glucan were as following：solid-liquid ratio 1∶40（g/mL），the concentration of NaOH 3%，extraction temperature 80℃and extraction time 1.5 h.Under these conditions，the yield of β-glucan was 19.38%.The process was simple and inexpensive and had higher extraction rate.

wine yeast；β-glucan；alkaline process；extraction

TS209

B

1002-0306（2015）18-0286-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.049

2015－01－22

杨婷（1991-），女，硕士研究生，研究方向：葡萄及葡萄酒研究，E-mail：lalating2009@163.com。

杨学山（1977-），男，副教授，研究方向：生物化学与生物产品研发，E-mail：yangxs@gsau.edu.cn。

甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目（GNSW-2013-21）。