海红果酒中白藜芦醇及其糖苷的检测方法研究

丁勇

（陕西科技大学生命科学与工程学院，西安陕西710021）

海红果酒中白藜芦醇及其糖苷的检测方法研究

丁勇

（陕西科技大学生命科学与工程学院，西安陕西710021）

建立一种基于反相液相色谱检测海红果酒中白藜芦醇及其糖苷的分析方法。研究海红果酒预处理条件及高效液相色谱条件，确定最佳预处理方法为壳聚糖脱色，再采用甲酸乙酯为萃取剂在4℃、pH 2处理脱色后样品。高效液相色谱条件为乙腈和水作为流动相进行梯度洗脱，在波长306 nm条件下检测反式白藜芦醇及反式白藜芦醇苷。结果显示白藜芦醇及其糖苷的加样回收率为98.6%～104.2%，基线平稳，精密度好，适合对海红果酒中的白藜芦醇及其糖苷的定量分析。

海红果酒；白藜芦醇；白藜芦醇苷；高效液相色谱

海红果是蔷薇科植物海红树的果实，是我国稀有果树资源，主要产区为陕西省府谷县。海红果含糖量在10%～15%，滴定酸含量在1%左右，同时含有大量的维生素、多酚类化合物、微量元素，其果汁酸甜适口、风味独特适合酿造果酒。白藜芦醇属多酚类化合物，在植物内主要以白藜芦醇及其糖苷的形式存在，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗心血管疾病、调节免疫、抗衰老等作用［1-6］。目前，葡萄酒中白藜芦醇的分析主要利用高效液相色谱、气质联用、毛细管电泳法等手段，采用直接进样快速分析的方法［7-8］。海红果酒（样品为企业委托开发的成品果酒）具有单宁、黄酮类化合物含量高，色泽深，白藜芦醇含量低的特点，采用类似葡萄酒中白藜芦醇直接进样的高效液相色谱检测，基线背景噪声大、出峰多，为提高色谱柱的分辨率和使用寿命，本试验主要研究样品的预处理方法及高效液相色谱条件，建立适合海红果酒的白藜芦醇及其糖苷的检测方法。

1材料与方法

1.1样品

海红果酒。

1.2主要仪器

WATERS 1525型高效液相色谱仪；WATERS 2487 Dual λ型紫外检测器；EMPOWER化学工作站；UPHW-IZ-90T纯水制造系统；RE-5203旋转蒸发器；TG16-WS高速台式离心机。

1.3试剂

色谱纯乙腈（沪试）；超纯水；反式白藜芦醇标准品（沃凯，纯度≥99%）；反式白藜芦醇苷标准品（沃凯，纯度≥99%）；色谱纯甲醇（沪试）；甲酸乙酯（沪试，分析纯）；乙酸乙酯（沪试，分析纯）；丁酸乙酯（沪试，分析纯）。

1.4色谱条件

色谱柱：Diamonsil（C18 5μm 250mm×4.6mm），配有C18保护柱；流动相：A为乙腈，B为水；柱温：室温；流速：1 mL/min；进样量：20 μL；检测波长：306 nm［9-12］。

1.5试验方法

取适量海红果酒，经脱色、过滤后，用2 mol/L的盐酸调整pH，精确移取不同pH的海红果酒样品至分液漏斗中，用等体积甲酸乙酯、乙酸乙酯、正丁酸乙酯萃取3次，萃取时间为20 min，有机相、水相、乳化层分开收集，乳化层在4 000 r/min离心15 min分离有机相和水相，合并有机相。在旋转蒸发仪低温蒸发，残留物用50%甲醇水溶液溶解，0.45 μm油膜过滤，滤液超声脱气10 min，按1.4所述的色谱条件进行定量检测。1.6脱色率

在波长440 nm下测定样品的透光率，脱色率为

式中：A0为脱色前样品的吸光度；A1为脱色后样品的吸光度。

2结果与分析

2.1条件优化

2.1.1脱色

海红果酒色泽呈深棕褐色，且单宁含量高，通过澄清、脱色后才能进行高效液相色谱分析。超滤澄清效果较好，但脱色效果差，因此采用吸附剂吸附脱色效果较好。试验选择了活性炭及壳聚糖作为脱色剂，考察了不同处理条件的脱色效果如图1、图2所示。

图1　活性炭不同处理条件对海红果酒脱色的影响Fig.1The influence of different processing conditions of activated carbon on decolorizing of circassian fruit wine

图2　壳聚糖不同处理条件对海红果酒脱色的影响Fig.2The influence of different processing conditions of chitosan on decolorizing of circassian fruit wine

活性炭脱色效果随温度的升高快速增加，温度在50℃以内，脱色效果差，脱色率低；适宜的脱色温度在60℃以上，用量在0.12 g/100 mL酒液时，脱色率低于80%。壳聚糖脱色温度低，脱色率在90%以上。综合考虑白藜芦醇的稳定性及脱色率，采用35℃、果酒自然pH、每100 mL果酒添加2.5 g壳聚糖的条件，在此条件下，脱色率达到92.6%，效果最佳。

2.1.2萃取剂的选择

萃取剂使用甲酸乙酯、乙酸乙酯、正丁酸乙酯，进行液液萃取，经HPLC定量分析，试验结果如图3所示。

图3　不同萃取剂对白藜芦醇及其糖苷萃取效果Fig.3Chromatograms of different extraction agents on the effect of resveratrol and its glucoside extracted standard of resveratrol and piceid

甲酸乙酯的萃取效果最好，提取率高，杂质峰干扰少，主要原因可能是白藜芦醇属非黄酮类的多酚化合物，易溶于有机溶剂，而黄酮苷类化合物易溶于水，通过有机溶剂萃取以与干扰物质分离，其中，酯类化合物的极性接近于白藜芦醇，因此可用来进行白藜芦醇及其糖苷的萃取。乙酸乙酯萃取反式白藜芦醇及其糖苷为甲酸乙酯的80%～92%，正丁酸乙酯萃取率为甲酸乙酯的30%～75%，萃取剂甲酸乙酯明显优于乙酸乙酯和正丁酸乙酯，萃取效果如图3所示。

2.1.3萃取pH

以2 mol/L的盐酸调整海红果酒的pH，甲酸乙酯为萃取剂进行液液萃取，白藜芦醇具有三个酚羟基，在低pH的条件下，H+浓度增加，减少酚羟基的水解，降低其极性，有利于白藜芦醇的有机溶剂萃取。试验结果如图4，在pH=2时及反式白藜芦醇及其糖苷提取量高，为最佳萃取pH。

图4　不同pH对萃取效果的影响Fig.4Effect of different pH on the extraction of resveratrol and piceid

2.1.4萃取温度

选取萃取温度为4、10、20、30℃，甲酸乙酯为萃取剂进行液液萃取，随着温度的降低，萃取率逐渐提高，白藜芦醇微溶于水，温度降低，溶解度随之降低，提高了液液萃取的分配系数，增加了在有机相的分配。试验结果如图5，在4℃条件下，反式白藜芦醇苷提取量高，为最佳萃取温度。

图5　不同温度对萃取效果的影响Fig.5Effect of different temperature on the extraction of resveratrol and piceid

2.1.5梯度洗脱程序

通过不同的梯度洗脱程序，对混合标准样品、海红果酒样品进行分离分析，从分离度、峰形、实际试样的背景及分析时间等多因素考虑，最终确定的梯度洗脱程序如表1所示。

表1　梯度洗脱程序Table 1Program of gradient elution

2.2标准曲线和检测限

在选定的色谱条件下，反式白藜芦醇及反式白藜芦醇苷保留时间如图6所示。

图6　白藜芦醇及白藜芦醇苷标准品色谱图Fig.6Chromatogram of standard of resveratrol and piceid

在设定的色谱条件下，分别取20 μL系列混合标准溶液分析。以反式白藜芦醇及白藜芦醇苷的质量浓度为横坐标，以检出峰面积为纵坐标进行线性回归，得到回归方程分别：

以S/N=3计算反式白藜芦醇及反式白藜芦醇苷的最低检测限分别为0.28、0.36 ng/mL。

2.3精密度和加标回收率

精密吸取反式白藜芦醇苷和反式白藜芦醇标准品混和液20 μL进样，对应色谱峰面积（n=5）的相对标准偏差（RSD）分别为1.12%、1.99%，反式白藜芦醇及其糖苷的加标回收率分别为98.6%、104.2%。

2.4海红果酒中白藜芦醇和白藜芦醇苷的分析

取海红果酒样品按方法1.5所述处理后进行高效液相色谱分析，结果如图7，反式白藜芦醇含量144.9 μg/L，反式白藜芦醇苷含量58.9 μg/L。

图7　海红果酒中白藜芦醇及白藜芦醇苷的色谱图Fig.7Chromatogram of resveratrol and piceid extracted from circassian fruit wine

3结论

1）直接进样杂质峰多、分离度差、很难定量分析，预处理能最大限度地减少杂质干扰，在样品预处理中，壳聚糖脱色时随温度升高脱色效果增加，当温度超过35℃，脱色率下降，35℃为最佳脱色温度。萃取剂的种类和萃取条件对萃取效率的影响很大，甲酸乙酯的萃取效率优于乙酸乙酯、正丁酸乙酯，但谱图出峰较多。综合分析甲酸乙酯为萃取剂在4℃、pH=2的条件为最佳的萃取条件。

2）采用乙腈和水作为流动相，优化梯度洗脱程序，流速1.0 mL/min，检测波长为306 nm。结果显示基线稳定、杂质干扰峰少、分离度较好、精密度佳，适合海红果酒中的白藜芦醇及其糖苷的定量分析。

［1］Aggarwal BB，Bhardwaj A，Aggarwal RS，et al.Role of resveratrol in prevention and therapy of cancer:preclinical and clinical studies［J］.Anticancer Res，2004，24:3-60

［2］Soleas GJ，Grass L，Josephy PD，et al.A comparison of the anticarcinogenic properties of four red wine polyphenols［J］.Clin Biochem，2002，35:119-124

［3］Whitsett T，Carpenter M，Lamartiniere CA.Resveratrol，but not EGCG，in the diet suppresses DMBA-induced mammary cancer in rats［J］.Carcinog，2006，5:15

［4］MEISHIANG J，LINING C，GEORGE OU，et al.Cancer chemo-preventive activity of resveratrol，a natural product derived from grapes［J］.Science，1997，275（1）:218-220

［5］Bradamante S，Bareghi L，Villa A.Cardiovascular protective effects of resveratrol［J］.Cardiovasc Drug Rev，2004，22（3）:169-188

［6］MERTENS-TALCOTT S U，PERCIVAL S S.Ellagic acid and quem-etin interact synergistically with resveratrol in the induction of human leukemia cella［J］.Cancer Letters，2005，218（2）:141-151

［7］CHEN X，HE H，WANG G，et al.Stereospecific determination of cis-and trans-resveratrol in rat plasma by HPLC:application to pharma-cokinetic studies［J］.Biomed Chromatogr，2007，21（3）:257-265

［8］杨红美，陈波，曾建国，等.HPLC同时测定虎杖及其提取物中4种有效成分的含量［J］.中国中药杂志，2006，31（3）:202-204

［9］张健，高年发.影响干红葡萄酒中白藜芦醇含量的因素分析［J］.中国酿造，2007（2）:12-15

［10］孙狄，章震兴，王轶男，等.高效液相色谱法测定红葡萄酒中白藜芦醇的四种异构体［J］.色谱，2004，22（4）:424-427

［11］王华，尉亚辉，王庆俐，等.葡萄酒中白黎芦醇的HPLC测定［J］.西北农业大学学报，1999，27（4）:83-87

［12］黄纪念，方杰，艾国民.HPLC法测定不同品种花生根中白藜芦醇的含量［J］.食品科学，2007，28（5）:276-277

HPLC Determination of Resveratrol and Piceid from Circassian Fruit Wine

DING Yong
（College of Life Science and Engineering，Shaanxi university of Science and Technology，Xi'an 710021，Shaanxi，China）

An analytical method of resveratrol and piceid that were extracted from circassian fruit wine was established.Through study of preprocessing and HPLC condition，the optimum pretreatment condition was as follows：decolorizingagentischitosan，pH2，andextractionsolventisethylformatethattreatssamplesat4℃，pH2.There were conditions of HPLC as follows：acetonitrile and water were adopted as mobile phase that conducts gradientelution，trans-resveratrolandtrans-piceidweredetectedatawavelengthof306nm.Theresultsappeared，in the selected condition，the recovery rate up to 98.6%-104.2%，the baseline smooth and precision well.This approachisqualifiedforquantitativeanalysisofresveratrolanditsglucosidefromcircassianfruitwine.

circassian fruit wine；resveratrol；piceid；HPLC

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.033

2014-05-04

丁勇（1974—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：发酵工程。