红米酒中多酚类化合物的高效液相色谱法测定

姜莉，王玉堂，周元，张强

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌712100）

红米酒中多酚类化合物的高效液相色谱法测定

姜莉，王玉堂*，周元，张强

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌712100）

建立高效液相色谱同时测定红米酒中11种多酚类化合物的方法。采用Venusil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，φ 5 μm）分离11种酚类物质，流动相为50%乙腈和超纯水，分别加1%乙酸，进样量20 μL，采用梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长260、320 nm。各组分的质量浓度与其峰面积具有良好的线性关系，相关系数均大于0.999 6，且11种酚类物质在45 min内得到了较好分离。方法回收率在88.6%～102.5%之间，相对标准偏差为0.76%～1.60%。本方法可用于红米酒中多酚类化合物的快速分析。

高效液相色谱；黄酮；酚酸；红米酒

红米以其颖果皮具有红色沉淀而得名，红米品种稻主要集中在云南、广西、湖南、贵州、广东、江西等省。红米含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素、核黄素、生物活性物质以及人体必需的微量元素Se、Zn、Fe、Mn、Ge等［1］，有研究表明，红米中含有的微量元素硒、锌等是普通稻米的2倍，并且VB1、VB2、脂肪、膳食纤维的含量也较普通稻米明显高。它是药食同源的滋补珍品［2］，具有较好的促进健康预防疾病的营养保健功效。马静、陈起萱等的研究表明，红米具有提高机体抗氧化能力，从而减少动脉壁细胞及其成分的氧化损伤［3］。红米酒是将红米通过一定的发酵工艺生产出的一种保健性米酒。在研究中发现，红米酒中有一定的多酚类活性物质，但鲜见有报道。黄酮、酚酸是多酚类化合物的总称，具有抗氧化、延缓衰老、降血压、防龋齿、防辐射、抗过敏、抗癌、抗血小板凝聚、消炎等功能特性［4］，在医药、食品添加剂等方面有广泛用途。由于高效液相色谱具有分析时间短，结果准确可靠等特点，近五年来得到迅速发展。利用高效液相色谱法对食品中黄酮、酚酸分析研究的文献已有不少［5-9］。本研究采用HPLCDAD法，测定红米酒中的黄酮、酚酸组成，并对其组分进行定量分析，建立8种酚酸及3种黄酮类物质的检测方法，为红米酒的保健功能提供参考。

1材料与方法

1.1材料

红米酒：超市购买。

1.2试剂

没食子酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸、芦丁、异槲皮素、槲皮素：均为标准品，均购于上海纯优生物科技有限公司；甲醇、乙腈、冰乙酸和乙酸乙酯为HPLC级：购于美国天地公司；试验用水为二次蒸馏水和超纯水：由西北农业科技大学实验管理处提供。

1.3仪器

液相色谱仪LC-20A高效液相色谱分析仪配紫外检测器：日本岛津；SHB-Ⅲ循环水式真空泵：郑州长城科工贸有限公司；RE52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；KQ-600DB数控超声波清洗器：江苏昆山超声仪器公司；PHS-3C酸度计：上海雷磁精科仪器厂。

1.4色谱条件

色谱柱VenusilC18柱（250 mm×4.6 mm，φ 5 μm）；流动相A 100%水（含1%乙酸），B 50%乙腈（含1%乙酸），低压梯度洗脱，流速1 mL/min，检测波长260、320 nm，柱温30℃，进样量为20 μL。

1.5方法

1.5.1红米酒中理化指标测定［10］

1.5.1.1pH的测定

使用两点标定法，即用pH 6.86和pH 4.00的缓冲液对PHS-3C型酸度计进行标定，然后测量红米酒中pH，重复3次。

1.5.1.2总酸的测定

取20 mL样液，置于150 mL烧杯中，加40 mL水在磁力搅拌的作用下，将标定好的酸度计的电极浸入样液中，边搅拌边滴加0.1 mol/L氢氧化钠标准，直至溶液pH=8.2。记录消耗0.1 mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数。重复测定3次。

式中：X为每升样品中酸的克数，g/L；M为氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，mol/L；V0为试样的取样量，mL；V1为滴定试液时消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；F为试液的稀释倍数；V2为空白试验时消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；K为酸的换算系数。

1.5.1.3酒度测定

采用蒸馏法将一定量样品进行蒸馏，然后用酒精计直接测定其读数。

1.5.1.4总糖测定

直接滴定法。

1.5.2多酚类物质的提取

取红米酒适量，用浓盐酸调至pH=2.0，然后准确吸取酒样品10mL，加入20mL水，加入乙酸乙脂30mL，超声辅助提取10 min，然后用分液漏斗进行萃取，待分层完全后，将下层液再次进行萃取，合并萃取液，在旋转蒸发仪中蒸干有机溶剂，干渣用2 mL 20%乙腈超声辅助溶解，得到多酚样品，用0.45 μm滤膜过滤，备用。

1.5.3标准溶液的配制

精确称取各标准品5mg，分别用甲醇定容至10mL得到每个标准品的贮备溶液500 mg/L，置于4℃冰箱中避光保存。分别移取1 mL各单个标准贮备溶液混合用乙腈定容至50 mL，得到多酚混合标准品使用液，浓度为10 mg/L。

1.5.4样品中各酚类物质含量的测定

式中：X样为样品的各酚酸含量，mg/L；A样为样品的各峰面积；C标为标准品的各酚酸含量，mg/L；A标为标准品的各峰面积；2/10为实际样品用量。

2结果与分析

2.1红米酒的理化指标

对红米酒中各项指标进行测定，结果见表1。

表1　红米酒的理化指标Table 1Physical and chemical indexes of red rice wine

2.2色谱条件的选择

2.2.1检测波长的选择

将11种500 mg/L的标准储备液配成50 mg/L的单标工作液，分别进行全波长扫描，得到各对照品的紫外吸收峰，以260、320 nm波长下出峰数及分离效果好。11种酚酸标准品色谱图见图1。

2.2.2流动相的选择

文献报道可以使用甲醇-水、乙腈-水等作为流动相分离酚酸。但是由于酚羟基、羧基在水溶液中发生电离，极性增强，在固定相表面形成双重保留，易出现拖尾现象。加入少量酸性试剂，可使多酚的电离受到抑制，以中性分子的形态存在，极性减弱，有利于增强在固定相上的保留，分离效果改善，不会出现峰拖尾的现象。经过比较，本试验选择的流动相A为含1%乙酸的超纯水，B为含1%乙酸的50%乙腈，获得较好的分离效果。

图111　种酚酸标准品色谱图（260、320 nm）Fig.1Chromatograms of 11 standards at 260 nm and 320 nm

2.2.3洗脱梯度选择

参考有关文献，通过试验对洗脱梯度进行优化，得到优化洗脱程序是：0 min～3 min，B为10%；3 min～15 min，B为15%；15 min～25 min，B为50%；25 min～35 min，B为60%；35 min～45 min，B为80%；45 min～50 min，B为80%；50 min～51 min，回到初始状态，B为10%；51 min～60 min用以平衡色谱柱，为下次进样做准备。该梯度能较好的将11种黄酮、酚酸分离，并且峰型面积和保留时间均很稳定。

2.3标准曲线的建立

分别取储备液适量，用甲醇配制0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10 mg/L的混合标准溶液，在确定的色谱条件下进样分析，平行测定3次，以标准品含量为横坐标，以平均峰面积为纵坐标得到11种物质的标准曲线，结果见表2。

表2　标准曲线与相关系数Table 2Standard cueves with correlation coefficients

从表2可以看到，相关系数均大于0.999 6，表明在此质量范围内，各对照品质量与峰面积相关性很好。

2.4精密度试验

取质量浓度为10 mg/L的混合标准品，重复进样6次，求得各色谱峰相对峰面积的RSD在0.76%～1.60%之间，色谱峰的个数及特征没有明显变化，精密度较好，见表3。

表3　方法的精密度和红米酒加标回收率（n=6）Table 3Precision and recover rates of red rice wine

2.5加标回收率试验

准确吸取红米酒10 mL，加入2 mL的10 mg/L的混合标准液，混匀后按照样品处理的方法进行处理，在色谱条件下重复3次，测得回收率见表3，加标回收率在88.6%～102.5%之间，说明本方法回收率较好。

2.6红米酒的组分分析

根据前述的样品提取条件和色谱条件，对红米酒中的黄酮和酚酸类物质进行组分分析，见表4。

从结果可以得到，红米酒中的标准物质含量差别较大，有8种酚酸和3种黄酮类物质检出，其中咖啡酸含量最高，为0.676 mg/L，结果见表4。

表4　红米酒中黄酮、酚酸组分分析Table 4Contents of flavonoids and phenolic acids in red rice wine

3讨论与结论

1）建立了可用于红米酒中黄酮、酚酸类化合物分析的高效液相色谱方法。采用50%乙腈-超纯水（含1%乙酸）为流动相，低压梯度洗脱，使黄酮、酚酸等组分在45 min内得到了较好分离。11种组分回收率在88.6%～102.5%之间，相对标准偏差为0.76%～1.60%。表明样品预处理方法可行。

2）通过对样品的检测，得到红米酒中含有多种黄酮与酚酸类物质。

3）试验过程中标准物质种类有限，尚有多种酚类物质未能确定，有待于进一步研究。

4）本研究仅对一种红米酒进行了黄酮、酚酸组分分析，原料单一，随后将对不同品种的原料生产出的米酒做进一步研究。

［1］魏毅，靳西彪，杨海亮，等.红米色素与微量元素硒之间关系的初步研究［J］.种子，2010，29（5）:1-4

［2］王丽华，叶小英，李杰勤，等.黑米、红米的营养保健功效及其色素遗传机制的研究进展［J］.种子，2006，25（5）:50-54

［3］谢黎虹，罗玉坤，陈能.红米和黑米的营养功效研究进展［J］.粮油食品科技，2005，13（1）:53-54

［4］Revilla E，Ryan M.Analysis of several phenolic compounds with potential antioxidant properties in grape extracts and wines by high perform ance liquid chromatography photodiode array detecrion with out sample preparation［J］.Joumal of Chromatography A，2000，881（1/2）:461-469

［5］李永库，李晓静，欧小辉.固相萃取-高效液相色谱法同时测定葡萄酒中没食子酸等8种多酚类化合物［J］.食品科学，2008，29（4）: 283-286

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Determination of Polyphenolic Compounds in Red Rice Wine by High Performance Liquid Chromatography

JIANG Li，WANG Yu-tang*，ZHOU Yuan，ZHANG Qiang
（College of Food Science and Engineering，Northwest A&F University，Yangling 712100，Shaanxi，China）

A method was developed for the simultaneous determination of eleven polyphenolic compounds in red rice wine，they were separated by HPLC on a Venusil C18（250 mm×4.6 mm，φ5 μm）column 30℃，Gradient elution was employed with a moble phase consisting of 50%acetonitrile and water，and add to 1% acetic acid，a solvent flow rate of 1.0 mL/min and an injection volume of 20 μL.Eleven polyphenolic compounds were identified at 260 nm and 320 nm.The method showed good linear correlations between the concentration and areas of the eleven components with correlation coefficients greater than 0.999 6，and were separated well in 45 min.The average recoveries were 88.6%-102.5%，with relative standard deviations of 0.76%-1.60%. The method can be applied to the rapid determination of polyphenolic compounds in red rice wine.

high performance liquid chromatography；flavonoids；phenolic acids；red rice wine

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.032

2014-02-11

西北农林科技大学大型仪器设备新功能开发项目（dysb130205）

姜莉（1968—），女（汉），高级实验师，硕士，从事食品化学与分析的教学及研究。