液相色谱-高分辨质谱法快速筛查蔬菜中20种氨基甲酸酯类农药

丁葵英，许文娟，孙军，郭礼强，李凯

（潍坊出入境检验检疫局技术中心，山东潍坊261041）

液相色谱-高分辨质谱法快速筛查蔬菜中20种氨基甲酸酯类农药

丁葵英，许文娟，孙军，郭礼强，李凯

（潍坊出入境检验检疫局技术中心，山东潍坊261041）

建立蔬菜中20种氨基甲酸酯类化合物高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱分析法。样品经乙腈提取，QuEChERS方法对样品净化后，采用高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱法对样品中的目标化合物进行定性分析，外标法定量确证。结果表明：20种氨基甲酸酯类农药在0.005 μg/mL～0.1 μg/mL范围内线性关系均良好，R2均大于0.99，且所有农药定量限（LOQ）（S/N=10）均低于国际限量要求；在0.01、0.02 mg/kg和0.04 mg/kg的添加水平下，蔬菜中20种氨基甲酸酯类农药的平均回收率介于60%～120%之间，相对标准偏差（RSD）不大于5.0%。该方法较为简单，只需全扫描并提取精确质量数即可进行准确定量，受基质干扰小，能很好的满足我国进出口蔬菜中20种农药限量的严格要求，可以用于蔬菜基质中此20种氨基甲酸酯类农药残留的检测。

静电场轨道阱；高分辨质谱；蔬菜；20种氨基甲酸酯

氨基甲酸酯类混合物农药是一种广泛使用的杀虫剂，具有杀灭效果强、分解代谢快、残留期短、高效、选择性强［1］，作用范围广等特点。近年来氨基甲酸酯类农药引起的中毒事件时有发生，2009年安丘大葱中“涕灭威亚砜”和最近“神农丹”事件，使得氨基甲酸酯类化合物的残留问题更加引起了人们的关注。氨基甲酸酯类化合物的品种多，毒性差别较大，能同时准确地检测多种此类农药十分必要。目前对于氨基甲酸醋类农药的检测方法很多，有酶联免疫吸附法［2］，该法灵敏度低无法满足当今社会的严格要求。液相色谱柱后衍生荧光法［3-4］，该方法应用最广泛，灵敏度高，但是柱后衍生过程繁琐，特异性不强，干扰严重。气相色谱质谱法（GC/MS）［5-7］，由于具有高选择性、成本低廉、易于操作且一次分析可以鉴定多种农药等优点，广泛应用于农药分析。然而，如果样品不进行衍生化处理，GC/ MS很难分析极性、热不稳定或低挥发性的化合物。由于部分氨基甲酸醋类农药的热稳定性较差，采用气相色谱法测定会造成分解，如涕灭威、甲萘威等，使得测定不准确，因此液相色谱比气相色谱更适合于氨基甲酸酷类农药的分析。液相色谱串联质谱法［8-11］是近年来发展起来的一种简便、准确、快捷、灵敏度高和检测限低的方法，可以在一次分析中定量和鉴定几百种目标化合物，具有很高的选择性和灵敏度，但常规的低分辨色谱-质谱法需要比较复杂的方法开发过程：如确认每个化合物的母离子、子离子和碰撞能量条件等，而采用高分辨质谱，只需采用简单的全扫描并提取精确质量数色谱图即可进行定量；此外，由于高分辨质谱的高选择性，进一步增强了抗干扰能力，目前关于高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱法测定氨基甲酸酯类化合物还鲜见报道。

本研究创建了一种利用高效液相色谱-静电场轨道阱质谱法快速筛查蔬菜中20种氨基甲酸酯类农药残留化合物，该方法操作简单、灵敏度较高，可以大批量筛查该类农药残留化合物，快速省时。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

Thermo scienticic Exactive orbitrap高分辨质谱仪、Dionex ultimate U-HPLC液相色谱仪（配有电喷雾离子源）：美国Thermo公司；GM200碾磨仪；电子天平：感量为0.1 g和0.001 g（MettlerAE163）；IKA T25均质器；冷冻离心机：德国Eppendof公司，5810R；氮吹仪（N-eovap111）；格兰仕WD9000微波炉；0.45μm针头过滤器；涡流混匀器：德国IKA。

甲醇、乙腈（色谱纯）：美国Fisher公司；乙酸乙酯（色谱纯）：德国Merk；甲酸（色谱纯）：美国，Tedia；无水硫酸镁（分析纯）：天津市光复精细化工研究所，用前在500℃马弗炉内烘5 h，200℃时取出冷却备用；石墨炭黑粉、C18、PSA粉和氨丙基粉：均购于Agelatechnologies inc公司；灭多威和杀线威标准品：购于Accustandard公司，100 μg/mL的液体标准品；其他18种氨基甲酸酯类标准品：均购于美国Sigma-Aldrich Laborchemikalien Gmbh公司，纯度≥95%。

蔬菜样品来自企业报检样品。

1.2方法

1.2.1标准溶液的配制

标准储备液：准确称取10 mg（精确至0.1 mg）硫双威、涕灭威、涕灭威砜、涕灭威亚砜、乙霉威、仲丁威、克百威、甲奈威、残杀威、抗芽威、猛杀威、茚虫威、速灭威、呋线威、乙硫苯威、异丙威、苯氧威和二氧威标准品，分别置于100 mL的容量瓶中，用甲醇溶解，准确定容至100 mL，得标准储备液，浓度100 μg/mL，存储期6个月；灭多威和杀线威液体标准品为100 μg/mL，纯度大于99.0%。

中间工作液：取上述各标准储备液1 mL于100 mL容量瓶，用甲醇准确定容，得标准中间工作液，浓度1 μg/mL，有效期3个月；以信噪比（S/N）≥10时的添加浓度确定本方法的检出限（DOQ）；分别移取各中间工作液5、10、25、25、50、80、100 μL混合于10 mL容量瓶中，用流动相准确定容，得0.005、0.01、0.025、0.05、0.08、0.10 μg/mL混合标准工作液（需当日新配），用于绘制标准工作曲线。

1.2.2样品处理

大葱、蒜苔切成约2 cm的小段，洋葱撕成片，姜等其他蔬菜打碎，然后取出部分有代表性的样品，缩分不少于500 g试样，装入清洁容器内，加封后标明标记备用；准确称取30.00 g上述样品，大葱、蒜苔和洋葱等样品需消解后转移至100 mL离心管中，其他样品直接称取30 g样品至100 mL离心管中，依次加入6 g无水硫酸镁，15 mL乙腈提取试剂，于高速分散机上充分均质，离心10 min（10 000 r/min），取上清液3 mL于10 mL玻璃试管中过粉净化，根据基质情况分别过石墨炭黑粉、C18、PSA粉和氨丙基粉，涡混2 min，静止分层后取2 mL上清液与另一干净玻璃试管中，氮气吹干，用1 mL流动相溶解，用一次性注射器吸取上述溶液，过0.45μm的滤膜，上机待用。

1.3LC-MS条件

1.3.1LC条件

色谱柱AgilentZORBAXSB-C18柱：3.0mm×100mm，φ1.8 μm；柱温：35℃；进样体积：20 μL；流速：0.3 mL/ min，共运行12 min；流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：甲醇。梯度洗脱程序见表1。

表1　液相色谱梯度洗脱条件Table 1Gradient Elution Conditions

1.3.2MS条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子（ESI+）模式扫描；检测方式：FT Orbitrap；质量范围：160-530，50-150，CID25V；鞘气流速：35 arb；辅助气流速：10 arb；喷雾电压：3 500 V；毛细管温度：320℃；毛细管电压：52.5 V；分辨率：50 000；离子源温度：200℃。

2结果与分析

2.1农药种类的确定

首先查阅了国内外对蔬菜产品中氨基甲酸酯类的种类和限量要求，并分别对国内及主要进出口国家CAC、欧盟、美国、日本、加拿大和澳大利亚等国家对氨基甲酸酯类化合物种类和限量的要求［4］，同时根据氨基甲酸酯类化合物的结构和性质确定化合物了20多种氨基甲酸酯类化合物；同时根据高分辨质谱仪的特点，根据一级全扫描并提取精确质量数进行定量的特点，筛选淘汰出灵敏度较低、无法满足限量值要求的农药，最终确定了氨基甲酸酯类化合物20种，基本满足了蔬菜产品中氨基甲酸酯类化合物残留检测的需求。

2.2流动相的选择

不同流动相对目标化合物的离子化影响较大［5］，从而影响目标化合物的影响值。本试验研究了0.1%的甲酸水-乙腈和0.1%甲酸水-甲醇体系作为流动相的对比试验，相同梯度比例的情况下，结果发现不同体系的流动相对待测物的出峰时间和离子化产生较大影响，乙腈作为有机相的体系中各农药出峰时间较早且较集中，同时较0.1%的甲酸水-甲醇体系中各农药的响应值较低，且重现性不好，故采用0.1%的甲酸水-甲醇作为本次试验的流动相体系。采用表1的梯度条件，12 min即可完成一个样品20种氨基甲酸酯类化合物的分析，大大缩短了分析时间。

2.3特征离子的选择

根据各农药的分子式数据库信息表，并指定离子加合物类型和数量，这里设定了正模式下的H+和Na+两种加合物离子，化合物筛选的离子提取窗口宽度为4 ppm。20种农药的0.1 μg/mL的混合标准品的H+和Na+加合离子提取色谱图见图1和图2。

图1　H+加合离子提取色谱图Fig.1Chromatograph of extracted H+adduct ion

图2　Na+加合离子提取色谱图Fig.2Chromatograph of extracted Na+adduct ion

由图1、图2可知：灭多威、涕灭威亚砜、涕灭威、杀线威、涕灭威亚砜、呋线威和茚虫威的Na+加合离子响应强度要高于H+加合离子的响应强度，特别是涕灭威和杀线威H+加合离子几乎不出峰，Na+加合离子峰是H+加合离子峰的几十倍，但因为Na+的来源不固定，故Na+加合离子不稳定响应值不稳定，涕灭威和杀线威选择Na+加合离子作为检测离子外，其他物质均选用H+加合离子为检测离子。其中仲丁威和猛杀威为同分异构体，在电源上加上25 V的电压，进一步寻找各自的子离子，其子离子检测图如下图3。

2.4质谱方法的建立

高分辨质谱仪不需要对质谱条件进行特殊优化，综合考虑灵敏度和仪器能承受的温度，离子源温度确定为200℃，其余离子条件为通用质谱条件，见1.3.2。用筛选软件建立各农药的分子式数据库信息表，并指定离子加合物类型和数量，这里设定了正离子模式下H+和Na+化合物离子。化合物筛选离子提取窗口宽度为4×10-6m，20种氨基甲酸酯类农药0.01 μg/mL标准溶液被检测，其各农药的分子式及检测离子等性质见表2。

图3　仲丁威和猛杀威的子离子色谱图Fig.3Chromatograph of Fenobucarb’s and Promecarb’s product ion

表220　种氨基甲酸酯类化合物性质Table 2The physical quality of 20 carbamate pesticides

2.5净化方法的确定

由于氨基甲酸酯类化合物极性较高，易与样品基质中的高极性化合物在质谱电喷雾电离源处发生离子化抑制现象而导致回收率偏低。此外，如果样品不净化可能污染仪器和缩短色谱柱使用寿命，但高分辨质谱仪具有较高分辨率能有效去除基体干扰，所以本试验选择较为简单的净化方法，改进的QuEChERS方法。根据不同粉末对不同干扰物质的净化作用，同时不能对目标化合物进行吸附，最终选用石墨碳50 mg，PSA100 mg，C18200 mg作为净化粉末，尽可能去除样品基质中的杂质，净化效果好，回收率理想。

2.6线性范围、定量限、精密度和准确度

配制20种氨基甲酸酯类化合物不同浓度的标准溶液，绘制标准曲线，以各目标组分定量离子色谱峰面积纵坐标，以各目标组分的质量浓度为横坐标绘制标准曲线，3种目标组分在0.005 μg/mL～0.10 μg/mL质量浓度范围内线性关系良好，相关系数R2均大于0.99，具体方程见表2。以目标组分特征离子的10倍信噪比（S/N=10）的加标水平为定量限，以平行测定7次的平均值作为该方法各目标物的LOQ。

以空白大葱和生姜样品试验，分别加入20种氨3结论

基甲酸酯类化合物，使得目标化合物在样品中的浓度分别为10、20、40 μg/kg，分别重复5次，按2.4和2.5的方法对样品进行处理和测定，结果表明所有目标物的添加平均回收率在55.3%～119.8%之间，相对标准偏差（RSD＜5%），能够满足国内外对蔬菜中氨基甲酸酯类残留量检测方法的要求。

本文根据氨基甲酸酯类化合物的结构特性和基质特点优化了提取条件和净化方法，建立了用乙腈提取、改进的QuEChERS方法对样品净化方法，应用HPLC与ExactiveOrbitrap质谱仪联用技术，建立并验证了快速而可靠地筛查多种农药残留的方法，在12min内完成20种氨基甲酸酯类农药筛查，Exactive质谱的高分辨率和高准确度确保了所有化合物的鉴定。该方法不但采用了非常简便的QuEChERS净化方法，同时采用只需全扫描和精确质量数的高分辨质谱法，所以该方法简便快速。此外，该方法具有较高的灵敏度，其定量限低于欧洲和日本法律所规定的限值，该方法能满足进出口企业蔬菜样品中农药残留限量检测的要求。

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Rapid Screening of 20 Carbamate Pesticides in Vegetables Using High Resolution Benchtop Oritrap Mass Spectrometer

DING Kui-ying，XU Wen-juan，SUN Jun，GUO Li-Qiang，LI Kai
（Technical Center of Weifang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Weifang 261041，Shandong，China）

A method with the High Resolution Benchtop Oritrap Mass Spectrometer was established to rapid screen and identify accurate Mass of 20 carbamate pesticides in vegetables.The samples were extracted by acetonitrile and purified by the QuEChERS，then qualitatively analyzed with the LC-OBMS and quantitatively analyzed with the external standard method.The results indicated the linearity of the method was good between 0.005 μg/mL and 0.1 μg/mL，and all the limits of quantities（LOQ）of this method can meet the international standard.Meanwhile，the average percent recoveries of the twenty pesticides ranged from 60%to 120%，and the relative standard deviations（RSDS）were all less than 5.0%，at three different addition levels（0.01，0.02 and 0.04 μg/mL）.This simple method，which can exactly quantitative analyze just by full scaning and extracting exact mass number，and can overcome the matrix-effect influence，can be used for the detection of the 20 carbamate pesticides in vegetables，perfectly satisfying the pesticide residues limit requirements.

orbitrap；high resolution mass spectrometer；vegetables；20 carbamate pesticides

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.031

2014-02-18

山东出入境检验检疫局项目（SK201284）

丁葵英（1982—），女（汉），工程师，硕士，主要研究食品中农兽药残留检测。