白首乌C21甾苷对慢性心力衰竭大鼠新生血管形成及胰岛素样生长因子—1表达的影响

惠勇

[摘要] 目的 探讨白首乌C21甾苷对慢性心力衰竭（CHF）大鼠新生血管形成及胰岛素样生长因子-1（IGF-1）表达的影响，探讨其防治CHF的可能作用机制。 方法 采用左冠状动脉前降支结扎术建立Wistar大鼠CHF模型，随机分为两组：模型组（n = 8）给予等体积生理盐水；白首乌C21甾苷组（n = 9）给予白首乌C21甾苷1.0 g/kg。另设假手术组（n = 10），给予等体积生理盐水。3周后进行左心室顺应性测量，并分别采用苏木精-伊红（HE）染色和流式细胞术测量微血管密度（MVD）和CD34+细胞阳性率。进一步采用Western blot和Real-Time PCR分析检测IGF-1蛋白和IGF-1 mRNA表达的变化。 结果 与模型组比较，白首乌C21甾苷组的左心室顺应性明显改善，MVD和CD34+细胞阳性率升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与模型组比较，白首乌C21甾苷组的IGF-1蛋白和IGF-1 mRNA的表达显著增强，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 白首乌C21甾苷可有效改善CHF大鼠左心室顺应性，对衰竭心肌有明显的保护作用，可通过IGF-1诱导CD34+细胞动员至外周血促进新生血管的形成。

[关键词] 白首乌C21甾苷；慢性心力衰竭；新生血管形成；胰岛素样生长因子-1

[中图分类号] R541.6 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）10（a）-0022-04

Effect of C21 steroidal glycoside of Cynanchum Auriculatum on angiogenesis and expression of insulin-like growth factor-1 in chronic heart failure rats

HUI Yong

Department of Geriatrics， the Second People′s Hospital of Mudanjiang City， Heilongjiang Province， Mudanjiang 157011， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of C21 steroidal glycoside of Cynanchum Auriculatum on angiogenesis and expression of insulin-like growth factor-1 （IGF-1） in chronic heart failure （CHF） rats and discuss its possible mechanism. Methods Anterior descending branch of left coronary artery was ligated to set up CHF Wistar rats model and rats were randomly divided into two groups： model group （n = 8） was administered equal volume of normal saline； C21 steroidal glycoside of Cynanchum Auriculatum group （n = 9） was administered orally C21 steroidal glycoside of Cynanchum Auriculatum according to 1.0 g/kg. Another sham group （n = 10） was administered equal volume of normal saline orally. After 3 weeks， left ventricular compliance was assessed. Microvessel density （MVD） and the positive rate of CD34+ cell was measured by HE staining and flow cytometry respectively. Further Western blot and Real-Time PCR were used to detect the protein and mRNA expression of IGF-1. Results Compared with model group， left ventricular compliance in C21 steroidal glycoside of Cynanchum Auriculatum group was improved significantly， MVD and the positive rate of CD34+ cell were elevated， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Compared with model group， IGF-1 protein and the expression of IGF-1 mRNA were enhanced significantly， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion C21 steroidal glycoside of Cynanchum Auriculatum has obvious protective effect on heart failure by improving effectively left ventricular compliance and promote the formation of neovascularization through inducing CD34+ cell mobilization to the outside blood by IGF-1.

[Key words] C21 steroidal glycoside of Cynanchum Auriculatum； Chronic heart failure； Angiogenesis； Insulin-like growth factor-1

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是常见的心血管疾病，常伴有心血管系统血流动力学障碍及神经内分泌代谢功能紊乱[1-2]。世界范围内大约有15亿例CHF患者，每年新增病例400万例[3]。现阶段，CHF是65岁老人住院的主要原因[4]。因此，寻找CHF安全有效的治疗方法或治疗药物显得尤为重要。白首乌C21甾苷能够清除超氧阴离子自由基和羟自由基，是白首乌中的主要活性成分[5]，但是，其对CHF的影响鲜见报道。本研究旨在观察白首乌C21甾苷对CHF大鼠左心室顺应性、微血管密度（MVD）、CD34+细胞动员及胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）表达的影响，为明确白首乌C21甾苷防治CHF提供实验依据，探讨其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康清洁级Wistar系大鼠40只，体重200～250 g，购于哈尔滨医科大学动物实验中心，实验动物合格证号：P00102012，实验动物使用许可证号：SYXK（黑）2012-033。饲养于标准环境，自由饮食，12 h光照周期。所有实验操作均遵守《中国动物实用指南》。

1.2 白首乌C21甾苷的提取

白首乌C21甾苷由牡丹江市第二人民医院炮制室制备。经紫外分光光度法分析，C21甾苷含量达65%左右（按孕甾烯醇酮计）。

1.3 方法

1.3.1 心肌梗死后CHF模型的建立及实验分组 参照文献[6-8]方法实施左冠状动脉前降支结扎术建立CHF模型。共成功建立CHF模型17只，成功率为56.7%。随机分为两组：模型组8只，给予等体积生理盐水；白首乌C21甾苷组9只，参照文献[9]并结合预实验结果，给予白首乌C21甾苷1.0 g/kg。另设假手术组10只，开胸后在左冠状动脉前降支下方只穿线不结扎，等体积生理盐水灌胃。各组均为1次/d灌胃，共3周。

1.3.2 流式细胞术 大鼠尾静脉采血0.5 mL、枸橼酸钠抗凝、Pharmingen染色缓冲液稀释。取2根试管，各加入100 μL全血，然后1管加入20 μL PE/cy5 anti-mouse CD34，另1管加入20 μL anti-CD34-FITC暗处孵育25 min后，加入2 mL红细胞裂解液，混匀，上机分析，计数10 000个细胞。Cell Quest Pro软件进行分析CD34+细胞阳性率。

1.3.3 左心室舒张期压力-容积曲线 大鼠断颈处死、心包膜剪开、肺动脉切断、主动脉插管、制备Langendorff心脏。通过贝朗Infusomat P型容积输液泵灌流改良KH（Krebs-Henseleit）灌流液。由心尖部将双腔心导管引入左心室，另一端连接HM10高精度压力传感器。把心脏放入37℃保温槽，逆灌10 min，改为顺灌10 min，稳定10 min。剪开左心耳，经左心房将自制顶端有乳胶球囊的聚乙烯导管插入左心室，乳胶球囊注入37℃ KH液。最初量为0.1 mL，并以此量递增，共7次，终容积为0.7 mL，4 s/次。SLY-B四道生理记录仪同步记录不同球囊容积时左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张期末压（LVEDP）、平均左心室内压最大上升和下降速率（±dp/dtmax）。以LVEDP为纵坐标，左心室球囊容积为横坐标，绘制左心室压力-容积曲线，以此反映心肌舒张期顺应性[10-12]。测定完成后，取心脏，剪去心房和血管组织，从心室处沿室间隔剪开，用于后续实验。

1.3.4 MVD测量 心肌组织标本4.0%多聚甲醛固定、石蜡包埋、苏木精-伊红（HE）染色，显微镜观察。随机选择3个高倍视野进行拍照。Image-pro Plus 6.0软件系统进行微血管计数，取其平均值。

1.3.5 Western blot分析 心肌组织标本在蛋白酶抑制剂存在下匀浆，以获得蛋白提取物。Bradford法测定蛋白质含量。95℃变性5 min，随后进行电泳。电泳后，电转至0.45 μm硝酸纤维素膜，5%的脱脂奶粉PBST封闭1 h，分别加入抗IGF-1抗体（1∶2000稀释）4℃孵育过夜。加入HRP标记的二抗（1∶2000稀释）室温孵育2 h。按同样的方法与甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体孵育。ECL化学发光试剂显色，通过Bio-Rad凝胶成像进行目的条带的表达检测及分析。蛋白的相对表达强度=目标蛋白表达强度/GAPDH蛋白表达强度。

1.3.6 Real-Time PCR分析 按照Trizol试剂盒说明书抽提总RNA。Nanodrop 2000检测RNA纯度。使用M-MLV逆转录试剂盒（reverse transcriptase kit promega，Japan）进行逆转录反应成单链的cDNA，操作按照试剂盒说明书进行。利用PubMed查找相关基因序列，并利用引物合成软件Primer Premier 5.0设计引物，引物序列见表1。使用Quant SYBR Green PCR kit按照PCR引物进行扩增，用Applied Biosystems 7500型定量PCR仪测出ΔC值及熔解曲线，计算出相对基因表达量。每份样品检测3次。

表1 Real-Time PCR序列

注：IGF-1：胰岛素样生长因子-1；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

1.4 统计学方法

采用Graphpad 5.0软件进行描述性统计，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，多样本均数采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠左心室舒张期压力-容积曲线

随着左心室球囊容积的逐渐递增，与假手术组比较，模型组左心室顺应性下降（P < 0.05）。白首乌C21甾苷组可见曲线较模型组向左上移位（P < 0.05），说明白首乌C21甾苷可改善CHF大鼠左心室心肌顺应性。见图1。

与假手术组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05；LVEDP：左心室舒张期末压；1 mmHg = 0.133 kPa

图1 各组大鼠左心室舒张期压力-容积曲线

2.2 各组大鼠心肌组织MVD比较

与假手术组比较，模型组MVD明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；与模型组比较，白首乌C21甾苷组MVD明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05），说明白首乌C21甾苷促进CHF大鼠新生血管的形成。见表2。

表2 各组大鼠心肌组织MVD比较（血管数/mm2，x±s）

注：与假手术组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05；MVD：微血管密度

2.3 各组大鼠CD34+细胞阳性率比较

与假手术组比较，模型组的CD34+细胞阳性率升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；与模型组比较，白首乌C21甾苷组的CD34+细胞阳性率升高，差异有统计学意义（P < 0.05），说明白首乌C21甾苷可增强CD34+细胞动员到外周血。见表3。

表3 各组大鼠CD34+细胞阳性率比较（%，x±s）

注：与假手术组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05

2.4 各组大鼠IGF-1 Western blot分析结果

与模型组比较，白首乌C21甾苷组IGF-1表达水平显著增强，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2。

与假手术组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05；IGF-1：胰岛素样生长因子-1；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

图2 各组大鼠IGF-1 Western blot分析结果

2.5 各组大鼠IGF-1 mRNA Real-Time PCR分析结果

与模型组比较，白首乌C21甾苷组的IGF-1 mRNA表达水平显著增强，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图3。

与假手术组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05；IGF-1：胰岛素样生长因子-1；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

图3 各组大鼠IGF-1 mRNA Real-Time PCR分析结果

3 讨论

CHF是各种心脏疾病的终末阶段，是各种心脏病变引起心脏功能和结构的变化，最后导致心室泵血功能低下的临床综合征[13-16]。本研究结果表明，白首乌C21甾苷可有效改善CHF大鼠左心室顺应性，说明其对衰竭心肌有明显的保护作用。

CD34+细胞是血管内皮祖细胞和造血干细胞的共同标志物，而且是目前公认的外周血骨髓干细胞的标志物[17]。CD34+细胞能分化为内皮细胞，定向迁移到缺血或损伤部位并参与局部的血管新生[18]。另有研究表明，IGF-1在CD34+细胞向内皮细胞诱导分化中也起着十分重要的作用[19]。IGF-1是重要的心源性激素，发挥类似胰岛素的作用，在新生血管的形成过程中，起决定性的作用，表现为表达增强[20]。本研究结果发现，白首乌C21甾苷可使CHF大鼠MVD显著增高，说明其可促进新生血管的形成。为确定其可能机制，本研究采用流式细胞术测定了外周血CD34+细胞的阳性细胞百分率。结果发现，白首乌C21甾苷可使CD34+细胞动员至外周血增加，提示其促新生血管形成的作用可能与动员CD34+细胞至外周血有关。进一步采用Western blot和Real-Time PCR分析检测了IGF-1蛋白和IGF-1 mRNA的表达，发现白首乌C21甾苷可使IGF-1蛋白和IGF-1 mRNA呈高表达。因此，认为白首乌C21甾苷促进新生血管的形成机制可能是其使IGF-1诱导CD34+细胞动员至外周血，从而促进新生血管的形成。

综上所述，白首乌C21甾苷可有效改善CHF大鼠左心室顺应性，对衰竭心肌有明显的保护作用。同时白首乌C21甾苷促进新生血管的形成，其机制可能与IGF-1诱导CD34+细胞动员至外周血有关。

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（收稿日期：2015-07-05 本文编辑：李亚聪）