九香虫醇提物对运动大鼠骨骼肌抗氧化酶活性及其基因表达水平的影响

高颖晖周万红窦鹏戚一曼王敦

（1. 西北农林科技大学昆虫研究所，杨凌 712100；2. 西北农林科技大学体育部，杨凌 712100）

九香虫醇提物对运动大鼠骨骼肌抗氧化酶活性及其基因表达水平的影响

高颖晖1，2周万红1，2窦鹏1戚一曼1王敦1

（1. 西北农林科技大学昆虫研究所，杨凌 712100；2. 西北农林科技大学体育部，杨凌 712100）

旨在探讨补充九香虫醇提物对运动大鼠骨骼肌抗氧化酶活性及其基因表达水平的影响。对大负荷游泳训练大鼠补充剂量分别为各组平均体重的0.5、1.0和1.5 g/kg的九香虫提取物，在8周大负荷训练结束后测定骨骼肌抗氧化酶活性与表达水平。8周大负荷训练后，相比单纯大负荷运动组，补充九香虫提取物组SOD、CAT、GST三种抗氧化酶活性均显著增加，同时3种酶的编码基因表达水平也显著上调。说明补充九香虫提取物提高运动大鼠骨骼肌抗氧化酶系活性的机理之一是上调了编码基因的表达水平。

九香虫提取物；运动大鼠；骨骼肌抗氧化酶；表达水平；酶活性

九香虫（Aspongopus chinensis）是常用的昆虫源中药材，属于昆虫纲、半翅目、蝽科，其生药为干燥的成虫虫体。九香虫在中医中是一味常见的处方药，其药用记载最早见《本草纲目》中对其的药效描述“治脘膈气滞、脾肾亏损，壮元阳”［1］。目前，九香虫在中药中常用于治疗胃寒胀痛、肝胃气痛、肾虚阳痿和腰膝酸痛等疾病［2］。近些年随着科技的进步，研究发现九香虫体内的一些药用成分不仅对一些疑难病症具有良好的治疗作用，而且能促进机体新陈代谢、抗癌等作用；丰富的营养成分还具有很好的食疗滋补作用［3-7］。迄今，对于其上述药理作用尚无系统的研究报道。我们在前期的动物实验研究中发现，九香虫醇提物能显著增强大鼠运动能力，提高实验动物肌肉抗氧化酶活性，以及清除肌肉组织中过氧化物等作用［8］。本研究在我们前期研究基础上，以运动大鼠为实验对象，进一步探讨九香虫醇提物对运动大鼠骨骼肌抗氧化酶的影响及其分子机制，旨在为深入理解昆虫药物的药理学和研发新的运动疲劳恢复补剂提供基础参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 供试动物为雄性SD大鼠，由西安交通大学医学院医学试验动物中心提供，一共50只，平均体重约240 g。大鼠被随机分为5组进行室内饲养。饲养在22-24℃常温条件下进行，室内通风、自然光照。大鼠自由饮水进食、标准混合饲料喂养。1.1.2 昆虫材料与浸膏制备 供试九香虫A. chinensis生药材购自西安中药材交易中心。将购回的九香虫材料于干燥箱中60℃干燥8 h，然后粉碎、过筛（20目），最后均匀混和后密封4℃冷藏保存。粉碎的九香虫材料用常温常压冷浸法［8，9］提取，萃取液旋蒸获得浸膏。浸膏溶解于分析纯酒精中，配制成浓度为1.0 g/mL的溶液，2℃保存。

1.2 方法

1.2.1 训练方法 适应性饲喂2周后，5组大鼠剔除生长不良和体重偏差较大的个体，重新随机分为4组，参考任启俊等［8］的实验方案进行实验。训练内容为：第1周适应性游泳60 min，第2周逐渐增加运动时间至150 min，每周训练6 d，共持续8周。4组处理中饲喂九香虫提取物的为3组，在每次训练后灌服该提取物剂量分别为各组平均体重的0.5、1.0和2.0 g/kg；大负荷训练对照组（CK）1组，每次训练后灌服5%乙醇水溶液安慰剂10 mL。第8周训练结束后，各组大鼠进行力竭游泳（采用大鼠开始实验时体重的8%为负重负荷），以大鼠沉入水中10 s不能浮出水面为力竭标准。

1.2.2 酶活性测定 在大鼠8周运动训练结束后，立即将其颈椎脱臼处死，切取其大腿部位骨骼肌，用冰浴预冷的生理盐水冲洗一次，滤纸吸除骨骼肌表面水分，加入液氮冰浴充分研磨后待用。每组骨骼肌样品中3 g用于RNA制备（每个处理3个重复、每个重复1 g样品）；剩余样品用生理盐水制成100 g/L匀浆液。随后在4℃下对剩余样品匀浆液离心（4 000 r/min、10 min），将上清液转移入灭菌离心管并置于-80℃冰箱保存备用。

3种抗氧化酶分别为过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽转移酶（GST）。它们的活性测定均根据试剂盒（南京建成生物工程研究所）说明完成。

1.2.3 RT-PCR分析 分别用Trizol（TaKaRa）提取前述步骤准备的各组骨骼肌样品中的总RNA，然后立即采用试剂盒RT reagent Kit Perfect Real Time（TaKaRa）进行反转录获得cDNA用于后续检测。3种抗氧化酶的RT-PCR检测采用20 μL体系，包括SYBR Premix Ex TaqⅡ反应液10 μL、引物各0.8 μL、模板DNA 2.0 μL、6.4 μL ddH2O。阶段I反应条件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 20 s，40个循环；65℃ 15 s。检测仪器为iCycler iQ5 RT-PCR仪（Bio-Rad）。内参基因（β-actin）、3个抗氧化酶基因检测引物序列如下：β-actin-F：5'-GAAATTGTGCGCGACATCAAGGA-3'；β-actin-R：5'-GCAATGCCCGGGTACATGGTGGT-3'。CAT-F：5'-ACAAGGCAATCCAGTCTATT-3'；CAT-R：5'-AATCGTCCAACAGGTATCAA-3'。GST-F：5'-GGGCATCTGAAACCTTTTGA-3'；GST-R：5'-GAGCCACATAGGCAGAGAGC-3'。SOD-F：5'-GCCTTGACTCTCCTGTAC-3'；SOD-R：5'-GCTCGTCCTATTATAGAATGTG-3'。

九香虫提取物添加实验组3种基因表达量以CK组的测定值为基准，求得倍数。

1.2.4 数据分析 分析用试验数据均为3次重复的平均值，采用SPSS软件（版本v12.0）对数据进行单因素t检验，显著性水平设置为α=0.05的显著和α=0.01的极显著。采用EXCEL制作图表。

2 结果

2.1 对大鼠骨骼肌抗氧化酶的活性的作用

由表1可知，与单纯大负荷运动组（CK）相比，九香虫提取物在3种添加水平下大鼠骨骼肌SOD活性均显著升高（P＜0.05），且随着添加水平的增加SOD活性明显呈极显著递增规律（P＜0.01）；与CK相比，CAT和GST活性均在0.5 g/kg时未发现显著变化（P＞0.05），但随着添加水平的增加，在CAT和GST活性均有极显著升高（P＜0.01）。

表1 九香虫提取物对大鼠抗氧化酶活性的影响

2.2 对大鼠骨骼肌抗氧化酶基因表达的影响

由图1可知，与单纯的大负荷运动组（CK）相比，补充九香虫提取物实验组动物的SOD基因表达水平均极显著升高（P＜0.01），且呈递增趋势。与单纯的大负荷运动组（CK）比较，补充九香虫提取物实验组0.5 g/kg添加水平即引起CAT表达水平的显著升高（P＜0.05）；并在1.0 g/kg和1.5 g/kg时，呈极显著升高（P＜0.01），且呈递增趋势。与单纯的大负荷运动组（CK）相比，当补充九香虫提取物剂量增加到1.0 g/kg以上时，GST表达水平显著升高（P＜0.01），其表达水平升高程度与九香虫提取物补充剂量呈正相关。

图1 三种抗氧化酶基因表达水平分析

3 讨论

在大负荷运动等原因引起动物体内自由基异常增多的情况下，这些自由基会造成肌细胞伤害，进而影响运动后的恢复、甚至造成运动能力下降［10］。清除自由基的抗氧化酶类是动物体内抗自由基、抗氧化系统的重要组成，这些酶类的存在使体内过氧化自由基的形成和清除保持动态平衡。因此，自由基拮抗剂的研究在运动营养领域中一直是备受关注的话题，国内外很多学者先后利用天然产物作为自由基拮抗剂，进而研发为抗氧化功能增进剂或运动恢复补剂［11-16］。前期研究发现九香虫提取物能够明显延长大鼠游泳力竭时间、提高抗氧化酶活性［8］，本研究结果证明以上作用的机理之一，是九香虫提取物能够上调实验动物肌肉中抗氧化酶编码基因的表达水平，动物体内3种抗氧化酶表达水平的上调引起运动大鼠骨骼肌SOD、CAT、GST活性的显著提高。说明九香虫提取物作为潜在的运动补剂，对抗肌肉细胞内过氧化反应的机制之一是促进了动物体抗氧化酶的表达水平、提高了动物抗氧化能力。前期研究发现九香虫提取物能够增强动物的运动能力［8］，推测也与其增强动物的抗氧化能力有关，这与壳聚糖对动物运动能力增强的机理类似［12］。

4 结论

运动大鼠补充九香虫提取物后，其骨骼肌中3种抗氧化酶活性均显著升高，同时3种抗氧化酶的编码基因表达水平也有显著升高。这种对运动大鼠骨骼肌抗氧化功能促进作用的机理之一，是上调了相关抗氧化酶基因的表达水平。

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（责任编辑 马鑫）

The Effects of Ethanol Extract from Aspongopus chinensis on the Activities of Antioxidant Enzymes in Skeletal Muscle of Exercised Rats and Their Gene Expression Levels

Gao Yinghui1，2Zhou Wanhong1，2Dou Peng1Qi Yiman1Wang Dun1
（1. Institute of Entomology，Northwest Agriculture and Forestry University，Yangling 712100；2. P.E. Department，Northwest Agriculture and Forestry University，Yangling 712100）

The effects of ethanol extract from Aspongopus chinensis（EEAC）on the activities of antioxidant enzymes in skeletal muscle of exercised rat and their gene expression levels were analyzed in this study. The EEAC was supplemented to rats that were given heavy-load swimming training at 3 dose levels of 0.5 g/kg， 1.0 g/kg and 1.5 g/kg based on the average weight of each group. The activities and encoded genes expression levels of antioxidant enzymes in skeletal muscle were measured after 8 weeks training. The activities of SOD， CAT and GST with EEAC supplementation were increased significantly compared to non-supplemented training rats， and the encoded genes for these 3 enzymes were up-regulated also. The results suggest that the one mechanism for the increase of antioxidant enzymes activities in skeletal muscle of exercised rats is that the expression levels of encoded genes were up-regulated by EEAC supplementation.

ethanol extract from Aspongopus chinensis；exercised rat；antioxidant enzymes in skeletal muscle；expression level；enzyme activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.021

2015-03-30

高颖晖，女，硕士，讲师，研究方向：运动生理生化；E-mail：yinghuigao@aliyun.com

王敦，男，博士，教授，研究方向：生物化学与分子生物学；E-mail：dunwang@foxmail.com