HPLC法同时测定地锦草中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的含量

汪　慧，钱巧珍，王　静，顾亚琴，舒　燕，郦红岩

HPLC法同时测定地锦草中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的含量

汪慧，钱巧珍，王静，顾亚琴，舒燕，郦红岩

目的 建立同时测定地锦草药材中芦丁、异槲皮苷和紫云英苷含量的高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）测定方法。方法 色谱柱： Kromasil C18（5 μm，250×4.6 mm）；流动相：乙腈-水-冰醋酸（20:80:0.15）；流速为1.0 ml/min，检测波长：360 nm，柱温：30 ℃。结果 芦丁、异槲皮苷、紫云英苷三种成分的相对保留时间分别约为8.1、10.5、16.1 min，能够达到基线分离，分离度分别为2.8、4.1、3.8；回收率分别为100.43%、100.34%、100.32%；线性范围分别为0.660～21.200、0.486～15.560、0.480～15.200 μg。结论 HPLC测定法简便准确，重复性好，为地锦草的质量控制提供了依据。

地锦草；芦丁；异槲皮苷；紫云英苷；高效液相色谱法

地锦草为大戟科植物地锦Euphorbia humifusa Willd.或班地锦Euphorbia maculata L.的干燥全草，是中医、维医常用药材，药用价值高，具有清热解毒、凉血止血、利湿退黄功效，可用于治疗痢疾、泄泻、咯血、尿血，便血、崩漏、疮疖痈肿、湿热黄疸［1-3］。其主要成分有黄酮类、三萜类、香豆素类、甾醇类、鞣质及酚酸类化合物。目前，对地锦草中黄酮类成分的含量测定报道较多，2010版《中国药典》也将槲皮素列为其含量检测指标，但未见同时测定地锦草中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷含量的报道，本研究通过参考相关文献［4-6］，对地锦草中的这3种成分进行了含量测定，为地锦草的质量控制提供依据。

1　材料与方法

1.1材料 岛津LC-10A高效液相色谱仪，LC-10ATVP泵，SPD-10AVP可见紫外检测器；浙大智达N2000双通道色谱工作站；Satorius CP225D电子天平；Branson SB3200超声波清洗器；金坛中大HH恒温水浴锅。

芦丁对照品（购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：100080-200707）、异槲皮苷（购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：111809-201403）、紫云英苷对照品（购自上海源叶生物科技有限公司，批号：20130420），乙腈、冰醋酸为色谱纯，水为注射用水，其余试剂均为分析纯。地锦草药材（购自江苏九泰医药有限公司）经江苏大学欧阳臻教授鉴定。

1.2方法

1.2.1色谱条件 色谱柱：Kromasil C18（5 µm，250× 4.6 mm）；流动相：乙腈-水-冰醋酸（20：80：0.15）；流速：1.0 ml/min；柱温：30oC；检测波长：360 nm；进样20 μl。理论板数：按芦丁峰计算应不低于3000。

1.2.2对照品溶液的制备 精密称取芦丁、异槲皮苷、紫云英苷对照品适量，加乙睛-水溶液（90∶10）制成含芦丁、异槲皮苷及紫云英苷均为0.1 mg/ml的混合溶液，即得对照品溶液。

1.2.3供试品溶液的制备 取地锦草药材，粉碎，过筛，精密称取2.0 g，置索氏提取器中，加石油醚（60～90℃）回流至无色，弃去醚液，药渣挥至无醚味，转移至具塞锥形瓶中，精密加70%乙醇50 ml，密塞，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 ml，置25 ml量瓶中，加流动相定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

1.2.4线性关系的考察 精密吸取不同浓度的对照品溶液注入液相色谱仪，以进样量（μg）为横坐标（X），以峰面积积分值A为纵坐标（Y），进行线性回归，绘制标准曲线，计算得回归方程。

1.2.5精密度试验 精密吸取同一浓度的混合对照品溶液，依法测定，连续进样5次，测定峰面积，考察其精密度。

1.2.6供试液稳定性试验 取同一供试液样品，分别在0、2、4、6、8、12、24 h测定峰面积，计算每一成分峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），观察其在24 h内的稳定性情况。

1.2.7重复性试验 分别精密称取同一份药材样品6份，按“供试品溶液的制备”项步骤操作，测定，计算样品中各成分的含量以及RSD。

1.2.8回收率测定 精密称取已知含量的样品6份约1.0 g，分别加入芦丁、异槲皮苷、紫云英苷对照品溶液，按“供试品溶液的制备”项下步骤处理，得供试品溶液。进样，计算各成分的回收率情况。

1.2.9样品测定 分别精密称取不同批次的地锦草药材，按“供试品溶液的制备”项下操作、测定，计算药材中各成分的含量。

2　结 果

2.1线性关系的考察 芦丁、异槲皮苷、紫云英苷三种成分的相对保留时间分别约为8.1、10.5、16.1 min左右，能够达到基线分离，分离度分别为2.8、4.1、3.8。芦丁、异槲皮苷、紫云英苷对照品的标准曲线的回归方程见表1。芦丁在0.660～21.200 μg、异槲皮苷在0.486～15.560 μg、紫云英苷在 0.480～15.200 μg范围内呈良好的线性关系。

表1　芦丁、异槲皮苷、紫云英苷对照品的标准曲线

2.2精密度试验 各成分的精密度良好，芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的RSD分别为1.24%、1.43%、1.34%。

2.3供试液稳定性试验 样品在24 h内具有良好的稳定性，各成分峰面积RSD分别为1.86%、1.63%、1.75%。

2.4重复性试验 6份供试品中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷平均含量分别为15.187、22.453、9.264 mg/g，RSD分别为1.48%、1.53%、1.79%。

2.5回收率测定 加样回收率数据见表2。

2.6样品测定 不同批次的地锦草药材中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的含量数据见表3。

图1　芦丁、异槲皮苷、紫云英苷对照品与供试品溶液的色谱图

表2　芦丁、异槲皮苷、紫云英苷加样回收率试验结果

表3　不同批次样品中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷含量测定结果（mg/g）

3　讨 论

药材中同时测定芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的含量的报道较多［7，8］，但大多采用梯度洗脱来对样品进行分离，本研究经过筛选，采用等度洗脱来进行含量测定，简化了方法，降低了对仪器的使用要求，并获得了满意的效果。

流动相的选择：笔者曾对甲醇-乙腈-水、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-水-冰醋酸等流动相分别进行系统筛选优化，最后确定采用乙腈-水-冰醋酸系统作为流动相，并且对乙腈-水-冰醋酸的比例进行了调整试验，最终在乙腈-水-冰醋酸（20∶80∶0.15）的条件下，三种指标成分能够很好的达到基线分离，出峰时间适中，且其他成分对测定无干扰。样品提取条件的选择：在研究过程中分别进行了不同溶剂（甲醇、乙醇、50%乙醇、70%乙醇）、不同提取方法（加热回流、超声提取）和不同提取时间（0.5、1、1.5 h）的比较，最后确定以70%乙醇回流提取1 h较为合适，提取时间较短，有效成分不能完全提取，时间较长则有效成分被损耗。

［1］国家药典委员会. 中华人民共和国药典（一部）［M］. 2010版. 北京：中国医药科技出版社， 2010： 118.

［2］王婷婷， 文今福， 金松南. 地锦草的化学成分及药理作用研究进展［J］. 泰山医学院学报， 2012， 33（8）： 629-632.

［3］谢 奇， 李治建， 斯拉甫·艾白， 等. 地锦草化学成分及其抗真菌作用的研究进展［J］. 医药导报， 2011， 30（7）： 880-883.

［4］吕凤莲，宋韶锦，方 彬. HPLC法测定地锦草中芦丁的含量［J］. 齐鲁药事， 2010， 29（3）： 139-140.

［5］李 慧， 许 亮， 徐保利， 等. 5种地锦草药材中总黄酮及3个酚酸类成分测定研究［J］. 中成药， 2012， 34（ 7）： 1328-1332.

［6］黄 琪， 黄彩虹， 雷 鹏， 等. 地锦草药材HPLC指纹图谱及模式识别研究［J］. 中国实验方剂学杂志， 2013，19（12） ： 95-98.

［7］邸 学， 谷丽艳， 王海波， 等. HPLC同时测定桑叶中绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素含量［J］.中国实验方剂学杂志， 2014， 20（15） ： 92-95.

［8］王 幻， 唐 辉， 王国军， 等. HPLC测定天山花楸叶提取物中6种黄酮成分［J］. 中国实验方剂学杂志， 2014，20（15） ： 58-61.

（2015-03-10收稿 2015-04-15修回）

（责任编辑 张亚丽）

Simultaneous determination of contents of Rutin， Isoquercitrin and Astragalin in Herba Euphorbia by HPLC

WANG Hui， QIAN Qiaozhen， WANG Jing， GU Yaqin， SHU Yan， and LI Hongyan. Jiangsu Jibeier Pharmaceutical Joint Stock Limited Liability Company， Zhenjiang 212009， China

Objective To establish high performance liquid chromatography （HPLC） for simultaneously determinating the contents of rutin， isoquercitrin， astragalin in Herba Euphorbia. Methods The chromatographic column was Kromasil C18 （5 μm， 250×4.6 mm）； mobile phase was composed of acetonitrile-water-glacial acetic acid （20:80:0.15）； detection wavelength （360 nm）； column temperature （30℃）.Current speed was 1.0 ml/min. Results Relative retention time of rutin， isoquercitrin， astragalin were 8.1， 10.5 and 16.1 respectively， which can achieve the baseline separation， and the separation degree were 2.8， 4.1， 3.8， respectively； recovery rate were 100.43%， 100.34% and 100.32%， respectively； linear range of methods were 0.660～21.200， 0.486～15.560， 0.480～15.200 μg. Conclusions HPLC was simple， accurate and repeatable， and may provide the basis for quality control of Herba Euphorbiac.

Herba Euphorbia； Rutin； Isoquercitrin； Astragalin； high performance liquid chromatography

LI Hongyan， E-mail: lhy707@126.com

R284.1

10.13919/j.issn.2095-6274.2015.09.009

汪 慧，本科学历，工程师，E-mail： 5062342765@qq.com

212009 镇江，江苏吉贝尔药业股份有限公司

郦红岩，E-mail： lhy707@126.com