逐瘀通脉胶囊联合针刺对脑卒中大鼠皮质区病理变化的影响

詹宇豪，王智惠，张文丽，王亚飞，李　倩，李　旗

逐瘀通脉胶囊联合针刺对脑卒中大鼠皮质区病理变化的影响

詹宇豪1，王智惠2，张文丽2，王亚飞1，李倩2，李旗1

目的 观察逐瘀通脉胶囊联合针刺对脑卒中大鼠皮质区病理变化的影响。方法 将50只健康雄性SD大鼠随机分为5组：对照组（A）、模型组（B）、通脉组（C）、针刺组（D）及针药联合组（E），采用两血管法建立脑卒中模型，苏木精—伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）观察各组大鼠脑皮质病理改变，高倍镜下图像分析软件计数，检测神经元生存密度。结果 光镜下可见B组较A组皮质区的细胞排列紊乱，且有坏死软化病灶，神经元出现不同程度的细胞变性，神经元生存密度下降；C、D、E组较B组皮质区细胞坏死减少，变性程度减轻，血管及血管周围间质水肿好转，神经元生存密度增加；E组与C、D组比较，脑皮质区细胞排列较密集，部分锥体细胞胞体突起明显，大部分缺血神经元病理变化明显改善，神经元生存密度明显增加。结论 逐瘀通脉胶囊联合针刺可以明显改善大鼠脑皮质区神经细胞病理变化，增加神经元生存密度。

逐瘀通脉胶囊；脑卒中；针灸

脑卒中是临床常见病、多发病之一，又称脑血管意外，常见于中年以上人群的急性发作，可发生意识障碍、痴呆、肢体瘫痪和死亡，在脑血管疾病中呈逐年上升的趋势。在人类对抗脑血管疾病的历史进程中，中医针灸及中药发挥了非常重要作用。针灸可改善脑血流量，加速血管的修复和再生，逐瘀通脉胶囊可降低血液黏度，抑制血小板聚集，增加脑部供氧量，有关其临床应用已有文献［1］报道；而且针刺结合药物治疗脑血管病的疗效优于单纯针刺组或药物组，联合治疗在临床上存在一定的优势［2］，但其具体机制尚不明确。本研究观察逐瘀通脉胶囊联合针刺对脑卒中大鼠皮质区脑细胞的病理变化及神经元生存密度的影响，为脑卒中针药联合治疗提供理论基础。

1　材料与方法

1.1材料 健康雄性清洁级SD大鼠50只，体重240～300 g，购于北京维通利华公司，动物实验许可证号：SCXK（京）2014-0030；逐瘀通脉胶囊（国药准字Z20000138），购于哈药集团三精千鹤制药有限公司；30号1寸毫针，购于苏州天协针灸器械有限公司。

1.2分组及针药方法 动物随机分成正常组（A）、模型组（B）、通脉组（C）、针刺组（D）及针药联合组（E），每组10只。A组不做任何处理；B组以纯净水10 ml/（kg·d）灌胃；D组与E组于第1次脑缺血后2 h内给予针刺，以后1次/d针刺大椎、百会穴各30 min，每隔5 min捻针1次；C及E组每日给予逐瘀通脉胶囊0.4 g/（kg·d），在第1次脑缺血后2 h内立即灌胃治疗，以后1次/d。各组治疗均在上午10点左右进行，连续治疗5周，大鼠常规饲养自由进食。

1.3模型制备 通过双侧颈总动脉结扎建立脑缺血卒中模型，模型大鼠在l周内分2次，分别在第1天与第7天结扎双侧颈总动脉。术前禁水4 h、禁食12 h，10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉，颈部皮肤消毒，取颈部正中切口，钝性分离一侧迷走神经与颈总动脉，用4号丝线双重结扎颈总动脉，一侧结扎后间隔7 d后进行同法结扎对侧颈总动脉。大鼠术后置于保温毯上至苏醒，使其肛温保持在36.5～37 ℃。制作模型过程中未见死亡动物。

1.4脑皮质病理变化观察 以10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，开胸暴露心脏，用10号针头经左心室穿刺至主动脉，固定穿刺针后连接点滴管，剪开右心耳，立即用0.9%生理盐水快速灌注，直至肝脏颜色变浅、右心房流出清亮色液体时，用4%多聚甲醛先快后慢灌注固定，至大鼠尾巴僵硬，断头取脑，冰盘上快速去除脑干、小脑迅速分离出大脑顶叶皮质，肉眼观察脑皮质病理大体病理改变，10%多聚甲醛室温固定24 h后，石蜡包埋后连续做冠状切片，再进行HE染色观察病理变化。

1.5皮质神经元密度分析 在高倍镜下观察大鼠的顶叶皮质区切片，随机选择5个高倍视野拍照，用Image Pro Plus 6.0图像分析软件进行分析，计数神经元，计算平均数，转换为单位面积下数值，求出顶叶神经元密度，以“个/mm2”表示。

1.6统计学处理 使用SPSS 17.0软件进行统计分析，各组数据以表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结 果

2.1各组大鼠脑皮质区病理学改变 A组顶叶皮层组织较致密清晰，染色均匀，血管及血管周围间质形态结构正常，神经元胞质呈淡红色，胞核蓝染，细胞轮廓清楚，形态呈不规则形、颗粒状或锥体状，神经细胞的数目较多（图1A）。B组皮层组织结构紊乱，染色较淡，有坏死软化病灶，血管及血管周围间质水肿形态结构异常，部分血管扩张，小动脉出现管壁轻度增厚，可见内弹力膜出现厚薄不一的皱褶，管腔狭窄；血管平滑肌细胞部分增生，胞质轻度浓染，出现外膜胶原纤维增生的早期血管病变，血管内皮细胞部分脱落；神经元变性坏死，数量明显减少，排列稀疏，锥体细胞层变薄，核变浅，基质疏松及空泡形成，有的神经元中央尼氏小体溶解，核固缩、消失，隐约可见细胞轮廓的死亡细胞形成的鬼影细胞，大部分神经元出现不同程度的变性（图1B1、图1B2）。C组皮质神经元分布稍密集，部分染色均匀，锥体细胞层部分较规则，胞体部分突起。血管及其周围仍有部分水肿，内皮细胞未见脱落（图1C）。D组神经元数量增多，仍有部分细胞固缩、坏死，可见鬼影细胞，部分锥体细胞脱失，部分血管内皮细胞基本完整，部分小血管水肿减轻（图1D）。E组顶叶皮层组织神经元分布比较密集，组织结构紊乱及间质水肿减轻，鬼影细胞及细胞坏死明显减少，细胞变性程度减轻，大部分锥体细胞缺血明显改善，血管及血管周围间质水肿改善，小动脉管壁基底膜完整，内皮细胞基本正常（图1E）。

图1　各组大鼠脑皮质区病理学改变

2.2 大鼠皮质神经元密度计数 A组、B组、C组、D组与E组神经元平均生存密度计数分别为（338.2±15.6）、（158.7±17.2）、（213.2±14.4）、（184.2±12.5）、（255.5±11.7）个/mm2。与A组比较，B组大鼠皮质神经元生存密度下降，差异有统计学意义（F=8.27，P＜0.05）；与B组比较，C组（F=9.43，P＜0.05）、D组（F=8.85，P＜0.05）及E组（F=9.64， P＜0.05）大鼠神经元生存密度呈上升趋势，差异有统计学意义；与C组（F=14.02，P＜0.05）及D组（F=19.58，P＜0.05）比较，E组神经元密度明显增加，差异有统计学意义；但C、D组比较，差异无统计学意义（图2）。

图2　各组大鼠皮质神经元密度（个/mm2）

3　讨 论

脑卒中是神经内科最常见的疾病之一，患者中大约有80%～85%属于缺血性脑卒中。脑主要依靠葡萄糖有氧氧化提供能量进行生理活动，对缺氧敏感，缺血时间较长可引起严重的不可逆性损伤，即使是短暂的脑缺血也会引起能量代谢异常，并由此引发脑血流恢复后一系列生化反应，导致血管和神经元损伤。谷氨酸、兴奋毒性和自由基在引发脑损伤方面发挥了重要作用［3，4］。脑缺血后，过多神经递质进入突触间隙，激活了各种钙离子进入细胞的通道，三磷酸腺苷（adenosine triphosphate， ATP）能量供给衰竭，将钙离子排出细胞的能量降低，细胞内钙离子增加，激活各种脂酶，核酸酶和蛋白酶，这些酶在缺血状态下持续被激活直接引发细胞的结构损伤，改变了白细胞的趋向性以及细胞膜的通透性，这些变化进一步加重了缺血性神经元的损伤，尤其是大量吸附在受损内皮细胞上的白细胞可以进入脑实质，造成缺血后进行性脑细胞损伤。

针刺疗法和中药方剂在治疗脑卒中起到了重要作用，针刺可以减轻慢性脑缺血大鼠对脑组织自由基的反应性损伤，降低丙二醛、活性氧活性，提高超氧化物歧化酶等抗氧化作用产物的含量，以及自由基反应酶的活性，抑制脑细胞脂质过氧化、减轻自由基对脑组织的损伤作用［5］；头穴丛刺对慢性脑缺血后新生血管的形成有一定的促进作用［6］。神经元生存密度越高表明其生存程度越高，神经元变性、坏死及凋亡情况越少。本研究发现模型组大鼠皮层细胞排列稀疏，出现神经元体积缩小、变形等不同程度病理改变，如果细胞坏死后的酶类继续分解发展，则更进一步导致细胞溶解和消失。通脉组和针刺组较模型组神经元数量虽有所增多，神经元生存密度也见上升，但仍有部分细胞固缩、坏死；逐瘀通脉胶囊联合针刺组较通脉组和针刺组顶叶皮层神经元生存密度明显增加，细胞固缩、坏死明显减少，变性程度减轻。说明逐瘀通脉胶囊联合针刺可保护脑卒中缺血后皮质神经元的病理损伤，提高神经元生存程度；且逐瘀通脉胶囊联合针刺优于单一治疗组，针药联合应用抑制了脑神经细胞缺血缺氧引起的进一步病理改变，改善了脑细胞形态，可能是针刺和药物疗效相加的结果，也可能是针刺穴位后药物在体内的代谢及吸收过程产生了影响并起到了增效作用，但针药结合产生增效作用的确切机制并不清楚，这为进一步探索临床应用针药联合治疗疾病提供了实验依据。

［1］郭宏伟，周志鸿，曾树林，等. 逐瘀通脉胶囊对血管性痴呆患者认知功能及血清脂联素、超氧化物歧化酶浓度的影响［J］. 中国医药指南， 2011， 34（9）： 184-185.

［2］王华政， 王玉祥， 倪浩斌. 针药结合治疗脑梗死后血管性痴呆的临床疗效观察［J］. 现代诊断与治疗， 2015，26（1）： 57-67.

［3］Cappellari M，Tomelleri G， Di Matteo A，et al. Dide-Botcazo syndrome due to bilateral occlusion of posterior cerebral artery ［J］. Neurol Sci， 2010， 31（1）： 99-101.

［4］Allen C L，Bayraktutan U. Oxidative stress and its role in the pathogenesis of ischaemic stroke ［J］. Int J Stroke，2009，4（6）： 461-470.

［5］张文丽，詹宇豪，沈俊明，等.针刺对慢性脑缺血脑皮质区自由基相关指标影响及其机制［J］. 中国医学创新，2014， 11（15）： 31-33

［6］王春霞，孙远征.头穴丛刺法对慢性脑缺血大鼠海马血管内皮生长因子表达的影响［J］. 针刺研究， 2012， 37（5）： 375-379.

（2015-07-24收稿 2015-08-25修回）

（责任编辑 张亚丽）

Effect of Zhuyu Tongmai capsule combined with acupuncture on pathological changes of cerebral cortex in rats with cerebral apoplexy

ZHAN Yuhao1， WANG Zhihui2， ZHANG Wenli2， WANG Yafei1， LI Qian2， and LI Qi1. 1. Specialty of Acupuncture and Massage，College of Traditional Chinese Medicine， 2. Medical Research Center， North China University of Science and Technology， Tangshan 063000， China

Objective To observe the pathological changes of cerebral cortex in cerebral apoplexy rats after Zhuyu Tongmai capsule combined with acupuncture. Methods 50 healthy male SD rats were randomly divided into five groups： control group （A），model group （B）， capsule group （C）， acupuncture group （D）， and Zhuyu Tongmai capsule combined with acupuncture group （E）. Twovessel method was applied to build cerebral apoplexy models， then the changes of rat brain cortical pathology was observed through HE staining and test survival density of the neuron by using counting software at high magnification image. Results Cells in cerebral cortex are more disordered in group B than in group A under light microscope. There were some necrosis and softening lesions， neurons appeared in different degrees of cell degeneration， and survival density of neurons decreased in group B. Compared with group B， necrosis cells decreased， degeneration degree lessen， blood vessels and interstitial edema around blood vessels turned better， neural survival density increased in group C， D and E. Compared with group C and D， cerebral cortex cells arranged closely， dendrite of some pyramidal cells increased， pathological changes of most ischemic neurons improved， neural density increased significantly in group E. Conclusions Zhuyu Tongmai capsule combined with acupuncture can obviously improve the rats’ cerebral cortex nerve cell pathological changes and increase the neuronal survival density.

Zhuyu Tongmai capsule； stroke； acupuncture

ZHANG Wenli， E-mail: dianj@163.com

R74

10.13919/j.issn.2095-6274.2015.09.007

大学生创新创业计划项目（校级x2014008，省级国家级201410081030）；河北省中医药局项目（2014058）；唐山市科技局项目（13130293z）

詹宇豪，本科在读，E-mail： 815152835@qq.com

063000 唐山，华北理工大学：1.中医学院针灸推拿专业，2.医学实验研究中心

张文丽，E-mail： dianj@163.com