组织T细胞因子4、P糖蛋白和抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-xl在结直肠癌中的表达及其临床意义

杨伟　金田野　刘峰　孙政

广州医科大学附属广州市第一人民医院胃肠外科，广东广州510180

组织T细胞因子4、P糖蛋白和抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-xl在结直肠癌中的表达及其临床意义

杨伟金田野刘峰孙政▲

广州医科大学附属广州市第一人民医院胃肠外科，广东广州510180

目的探讨组织T细胞因子4（TCF-4）、P糖蛋白（P-gp）和抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-xl（Bcl-xl）在结直肠癌中的表达及其临床病理特征的关系。方法选取广州医科大学附属广州市第一人民医院2013年1～12月100例手术切除结直肠癌组织及距病灶10 cm以上的正常组织，应用免疫组化的方法，分别检测TCF-4、P-gp和Bcl-xl蛋白在结直肠癌组织及正常组织的表达，并分析其与临床病理的关系。结果TCF-4、P-gp和Bcl-xl在结直肠癌组织中的阳性表达率分别为85%、67%和84%，明显高于正常黏膜组织（9%、2%、7%），差异有统计学意义（P＜0.05）；结直肠癌组织中TCF-4、P-gp，Bcl-xl三者间表达呈正相关（r=0.301、0.581、0.390，P＜0.01）。结直肠癌组织中TCF-4和Bcl-xl阳性表达与肿瘤组织的分化程度呈正相关（r=0.390，P＜0.01），结直肠癌组织中TCF-4、P-gp，Bcl-xl阳性表达与患者年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、组织学类型之间无明显相关（P＞0.05），与浸润深度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期有关（P＜0.05）。结论结直肠癌组织中TCF-4、P-gp和Bcl-xl的表达与浸润、转移、TNM分期及复发密切相关，可作为判断结直肠癌患者预后的指标，P-gp和Bcl-xl在结直肠癌中的多药耐药机制可能与Wnt/β-Catenin-TCF信号通路TCF-4有关。

结直肠癌；组织T细胞因子4；P糖蛋白；抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-xl

结直肠癌（colorectal cancer）是近年来在国内外严重危害人类生命的恶性肿瘤之一［1］，其发病率和死亡率都呈上升趋势，目前主要采取手术和放疗、化疗为主的综合性治疗［2］，化疗是进展期结直肠癌治疗的重要临床措施，而化疗的最大障碍是结直肠癌细胞的多药耐药性（multidrug resistance，MDR）。由于结直肠癌细胞的MDR，是导致结直肠癌治疗失败的关键原因［3］。多种机制参与介导了肿瘤MDR的产生［4］，但MDR具体机制仍未明确，其中Wnt/β-catenin-TCF信号通路是研究的热点［5］，但有关Wnt/β-catenin-TCF信号通路中转录调控元件TCF对结直肠癌多药耐药相关基因的调控作用鲜有研究报道。本研究拟通过免疫组织化学的方法检测CRC组织T细胞因子4（T cell factor 4，TCF-4）、P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-xl（B-cell lymphoma-extra large，Bcl-xl）的表达情况，并结合临床资料分析其与临床病理特征的关系，探讨TCF-4、P-gp、Bcl-xl在结直肠癌发生、发展、MDR的作用及其相关性。

1　资料与方法

1.1一般资料

随机选择广州医科大学附属广州市第一人民医院2013年1～12月外科手术切除并有完整临床治疗的结直肠癌患者100例，所选病例术前均未接受化疗、放疗或者其他针对肿瘤的治疗。所有临床标本的使用均征得患者知情同意并通过医院伦理委员会审核批准后用于实验。其中男56例，女44例，年龄28～82岁，平均（64.3±0.1）岁；结肠癌64例，直肠癌36例；按WHO病理分级：高分化15例，中分化68例，低分化17例；按UICC标准行TNM标准临床分期：A期5例，B期33例，C期33例，D期29例。另外取其相配对癌旁10 cm正常黏膜组织作为对照。

1.2方法

TCF-4、P-gp、Bcl-xl免疫组织化学染色采用链霉素-生物素过氧化物酶（SP）染色法，严格按说明书操。TCF-4、P-gp、Bcl-xl单克隆抗体为即用型工作液，用已知阳性切片做阳性对照，用PBS做阴性对照。TCF-4、P-gp、Bcl-xl单克隆抗体、SP试剂盒及DAB显色试剂盒，以上材料均购买于福州迈新生物技术开发公司。

1.3判断标准

TCF-4蛋白在石蜡中阳性染色主要定位于细胞浆及细胞核，呈现棕黄色颗粒，Bcl-xl、P-gp蛋白在石蜡中阳性染色主要定位于细胞膜和/或细胞浆。根据肿瘤细胞显色的比例及染色强度。以阳性细胞率评分：计数10个高倍视野，阳性细胞数＜5%为0分，5%～25%为1分，＞25%～50%为2分，＞50%～75%为3分，＞75%为4分。以显色程度评分：淡黄色为1分；黄色为2分；棕黄色为3分。两项结果相加＜2分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+），4～5分为中度阳性（++），6～7分为强阳性（+++）。其中+～+++为阳性。

1.4统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差表示，两独立样本的计量资料采用t检验；计数资料以率表示，采用χ2检验或Fisher精确概率法。相关性采用Spearman相关性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1 TCF-4、P-gp、Bcl-xl在结直肠癌及正常组织的表达

TCF-4蛋白阳性表达主要定位于细胞浆及细胞核，以细胞核为主，呈现棕黄色颗粒（图1）；Bcl-xl、P-gp蛋白阳性表达主要定位于细胞膜和/或细胞浆，呈现棕黄色颗粒（图2～3）。

图1　组织T细胞因子4在组织中的阳性表达（SP，200×）

图2　P糖蛋白在组织中的阳性表达（SP，200×）

图3　抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-xl在组织中的阳性表达（SP，200×）

结直肠癌组织中TCF-4、P-gp、Bcl-xl阳性表达率分别为：85%（85/100）、67%（67/100）、84%（84/100），而在癌旁正常组织中的阳性表达率分别为：9%（9/ 100）、2%（2/100）、7%（7/100），癌组织显著高于正常组织，差异有高度统计学意义（χ2=115.937、93.484、119.548，P＜0.01）。

2.2结直肠癌组织TCF-4、P-gp、Bcl-xl表达的相关性分析

Spearman相关性分析显示：TCF-4与P-gp、Bcl-xl表达呈正相关（r=0.301、0.581，P＜0.01）；P-gp、Bcl-xl表达呈正相关（r=0.390，P＜0.01）

2.3结直肠癌组织TCF-4、P-gp、Bcl-xl的表达与临床病理参数的关系

TCF-4、P-gp及Bcl-xl在结直肠癌组织中的表达与患者发病年龄、性别、组织学类型、肿瘤部位、肿瘤大小无明显关系（P＞0.05）；但与浸润深度、淋巴结转移、远处转移、复发肿瘤者及TNM分期有关（P＜0.05）；不同分化程度的P-gp表达差异无统计学意义（P＞0.05），不同分化程度的TCF-4、Bcl-xl表达差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1　结直肠癌组织TCF-4、P-gp、Bcl-xl的表达与临床病理参数的关系［n（%）］

3　讨论

TCF-4是Wnt/β-catenin-TCF信号转导通路中的核内转录因子。Wnt通路对于细胞生长、分化的调控，是通过其核内转录因子TCF激活一系列靶基因的转录来实现的［6］。本研究发现TCF-4在结直肠癌中的表达率明显高于正常黏膜组织；TCF-4在结直肠癌组织中的表达与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、复发有关（P＜0.05），而且TCF-4阳性表达率随肿瘤浸润深度增加、分化程度增高、淋巴结转移、远处转移、术后复发而增高，这说明TCF-4蛋白表达增强时，肿瘤分期越晚，淋巴结转移越多，组织分化越差可能预后也越差。李春艳等［7］研究发现TCF-4高表达与NSCLC的分化密切相关。有的研究认为TCF-4的表达与浸润深度、淋巴结转移、远处转移及肿瘤复发有密切相关［8］。然而杨连赫［9］研究表明TCF-4蛋白的表达情况与患者的TNM分期显著相关，而与淋巴结转移无关，这可能与研究样本量少、检测手段的标准化不足有关。Potocnik等［10］研究表明Wnt通路是通过TCF-4激活MDR基因转录多药耐药蛋白实现，从而导致多药耐药。因此，TCF-4在细胞恶性转化的过程中起至关重要的作用，与结直肠癌的发生、预后相关。

P-gp是由MDRI基因编码、具有能量依赖性药泵功能，与药物结合，同时在其核酸结合位点上结合，水解后所释放的能量使药物泵出细胞外，同时使药物在细胞内再分布，使药物聚集于与药物作用无关的细胞器内，从而产生耐药［11］。本研究发现P-gp在结直肠癌中的表达率明显高于正常黏膜组织；P-gp在结直肠癌组织中的表达与浸润程度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期、肿瘤复发相关；表明P-gp参与结直肠癌的发生、发展及MDR的产生。P-gp在结直肠癌组织中伴淋巴结转移、远处转移者高表达；肿瘤侵犯程度越深、P-gp阳性表达率越高；术后肿瘤复发者P-gp蛋白阳性表达率比未复发者高。黎骋［12］研究表明P-gp表达与淋巴结转移、浸润深度有关。然而叶正龙等［13］研究表明P-gp表达与淋巴结转移及分化程度无关。也有研究认为：P-gp表达与TNM临床分期有关［14］。陈晓耕等［15］证实了P-gp的表达与肿瘤组织分化程度有关，分化程度越高，阳性表达率越低；而Nooter等［16］研究却得出了相反的结论；因此，有关P-gp的表达情况尚需进一步深入研究探讨。由此可见P-gp不宜用作判断肿瘤恶性程度的指标，其表达可能具有个体差异性。因此化疗前检测P-gp可有效预防盲目用药同时需根据P-gp动态变化适当调整化疗药物的使用，以免引起继发耐药。

Bcl-xl是Bcl-2家族的凋亡抑制基因，Bcl-xl可通过其分子表面的“疏水口袋”与含有BH3的促凋亡蛋白结合从而拮抗后者促进细胞凋亡的作用。此外Bcl-xl还可与Apaf-1、caspase-9形成复合物而抑制caspase-9等的激活，从而导致细胞内重要凋亡相关蛋白质的溶解并抑制细胞凋亡［17-18］。Konishi等［19］研究发现，直肠癌中hRFI过表达可以通过上调NF-κB活性的途径使Bcl-xl表达上调，从而抵抗5-FU诱导的线粒体凋亡通路。本研究发现Bcl-xl在结直肠癌中的表达率明显高于正常组织；与Bcl-xl在结直肠癌组织中的表达与患者肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期及肿瘤复发复发有相关性，而且Bcl-xl阳性表达率随肿瘤分化程度增高、浸润深度增加、淋巴结转移、远处转移、术后复发而增高，而与其他临床病理特征无关，这说明Bcl-xl蛋白表达增强时，肿瘤分期越晚，淋巴结转移越多，可能预后也越差，这与文献报道的研究基本相符合［20］。然而有研究表明，与肿瘤的浸润深度及淋巴结转移情况无关［21］。本研究表明分化程度差、浸润较深、有淋巴结转移、远处转移者肿瘤复发者，Bcl-xl蛋白表达阳性率较高。因此本研究认为Bcl-xl可作为反映结直肠癌恶性生物学行为及预后的潜在标志物，提示Bcl-xl在结直肠癌的发生发展中有重要作用，测定结直肠癌组织中Bcl-xl的表达可能对判断预后有一定帮助。

本研究结果显示，结直肠癌组织TCF-4、P-gp、Bcl-xl三者间表达呈正相关。Wang等［22］在大肠癌的研究中发现，P-gp的表达受β-catenin/TCF的调节，并且这种调节是通过TCF-4激活P-gp启动子而实现的。细胞质内由于β-catenin的积聚而进入核内与TCF-4形成激活复合体，再进一步激活TCF-4的下游靶基因，并使其表达增强，结果P-gp分泌增加；抗凋亡抑制基因Bcl-xl表达上调，参与抑制结直肠癌细胞凋亡的同时降低了结直肠癌细胞对化疗药物的敏感性，使细胞凋亡减少，细胞增殖失控，导致结直肠癌的发生、侵袭和转移及MDR，有研究表明P-gp与Bcl-xl呈正相关［21］，与本研究相一致，提示P-gp和Bcl-xl在结直肠癌中的高表达可能是协同导致MDR。

综上所述，深入研究TCF-4、P-gp、Bcl-xl三者之间作用调控机制及其相互之间的关系，对揭示结直肠癌的发病机制、进展及MDR有重要意义；联合检测TCF-4、P-gp和Bcl-xl不但有望成为结直肠癌的早期诊断和判断预后的重要指标，而且为结直肠癌临床上的靶点治疗提供新的依据和思路，为不同患者制订个体化治疗方案，为评估化疗方案的疗效提供理论依据。

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Expression and clinical significance of T cell factor 4，P-glycoprotein and Bcl B-cell lymphoma-extra large-xl in colorectal cancer

YANG WeijinTIAN YeLIU FengSUN Zheng▲
Department of Gastrointestinal Surgery，Guangzhou First People's Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University，Guangdong Province，Guangzhou510180，China

Objective To investigate the expressions of T cell factor 4（TCF-4），P-glycoprotein（P-gp），and B-cell lymphoma-extra large（Bcl-xl）and their relationship with clinical pathological characteristic in tissues of colorectal cancer.Methods From January to December 2013，in Guangzhou First People's Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University，TCF-4，P-gp and Bcl-xl expression were assessed by immunohistochemistry in paraffin samples from 100 colorectal cancer specimens and normal colorectal mucosa specimens（more than 10cm away from the cancerous lesions）.Relationships among TCF-4 expression，P-gp expression，Bcl-xl expression and clinicopathological characteristics were analyzed.Results Expression rate of TCF-4，P-gp and Bcl-xl in colorectal cancer specimens were 85%，67%and 84%，these were higher higher than those in normal colorectal mucosa（9%，2%，7%），the differences were statistically significant（P＜0.05）.The expressions of TCF-4，P-gp and Bcl-xl in cancerous tissues were positively correlated with each other（r=0.301，0.581，0.390，P＜0.01）.The expressions of TCF-4 and Bcl-xl in cancerous tissues were positively correlated with the differentiation of tumor（r=0.390，P＜0.01），the expressions of TCF-4，P-gp and Bcl-xl were no significantly correlated with the age，the gender，tumor sides，tumor location，histological types（P＞0.05），but they were significantly correlated with depth of invasion，lymph node metastasis，tumor metastasis，TNM stage，tumor recurrence（P＜0.05）.Conclusion TCF-4，P-gp and Bcl-xl are overexpressed in colorectal cancer and correlated with tumor invasion，lymph node metastasis tumor metastasis，TNM stage，tumor recurrence，and they can be used as prognostic factors in patients with colorectal cancer.In the multidrug resistance mechanism of colorectal cancer，P-gp and Bcl-xl may connect with TCF-4 of Wnt/β-Catenin-TCF signal pathways.

Colorectal cancer；T cell factor 4；P-glycoprotein；B-cell lymphoma-extra large

R735.3

A

1673-7210（2015）12（b）-0075-05

2015-08-13本文编辑：苏畅）

广东省社会发展领域科技计划项目（93077）。▲