S100A4和P53蛋白在肥厚型心肌病心肌纤维化中的表达及意义

戚晓琳　韩继召　董娴宁　赵鹏▲

1.青岛大学医学院，山东青岛266071；2.山东省青岛市公安局刑警支队法医科，山东青岛266034；3.青岛大学附属医院病理科，山东青岛266061

S100A4和P53蛋白在肥厚型心肌病心肌纤维化中的表达及意义

戚晓琳1韩继召2董娴宁3赵鹏3▲

1.青岛大学医学院，山东青岛266071；2.山东省青岛市公安局刑警支队法医科，山东青岛266034；3.青岛大学附属医院病理科，山东青岛266061

目的研究肥厚型心肌病（HCM）患者心肌细胞中S100A4、P53蛋白的表达，探讨其与HCM心肌纤维化的关系。方法选择2013年1月～2014年6月就诊于北京阜外心血管医院的HCM手术患者10例作为HCM组，10例青岛地区交通事故及高坠致死者心肌组织为对照组。应用苦味酸天狼星红染色法比较两组的胶原容积分数；运用免疫组化法比较两组心肌组织内S100A4、P53阳性表达情况；运用原位杂交方法检测S100A4、P53 mRNA表达情况。结果HCM组心肌间质胶原容积分数显著高于对照组（P＜0.01）。HCM组心肌组织S100A4、P53的IOD值均高于对照组，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。HCM组心肌组织S100A4、P53的原位杂交值均高于对照组，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。结论S100A4、P53蛋白过度表达可能在HCM心肌纤维化过程中发挥重要作用，可能为HCM心肌纤维化的治疗提供新的方向。

肥厚型心肌病；心肌纤维化；S100A4；P53

肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）是常见的遗传性心肌病，是以心肌非对称性肥厚、左心室充盈受限、心室腔变小、舒张期顺应性下降为特征的心肌病［1-3］。HCM是青壮年心源性猝死（sudden cardiac death，SCD）的首要病因［4］。HCM年死亡率约为1%，世界范围内的发病率约为0.2%［5］。HCM心肌纤维化，尤其是瘢痕形成被认为是导致恶性心律失常的重要原因［6-7］。HCM患者发生猝死主要由恶性心律失常所致。因此对于HCM心肌纤维化的发生机制及其影响因素的研究已经成为HCM的研究热点。

S100A4是钙离子结合蛋白家族成员之一，S100A4蛋白定位在细胞核中，有报道证实，S100A4参与心肌纤维化的发生，从而导致心肌胶原蛋白过度降解，引发心脏组织重构［8-9］。它还能调节DNA与P53结合并影响其功能［10］。然而S100A4在HCM心肌组织中的作用机制还不清楚。本研究主要探讨S100A4在心肌纤维化中的作用及其与P53的关系。

1　资料与方法

1.1一般资料

选择2013年1月～2014年6月就诊于北京阜外心血管医院的HCM手术患者10例作为HCM组，排除标准：患有严重感染、肿瘤、肾衰竭、自身免疫疾病、结缔组织疾病和其他严重慢性病者［11］。10例交通事故及高坠致死者心肌组织为对照组，纳入标准：无心血管及严重慢性病病史，无心律失常、心肌肥厚及心脏结构性病变。本研究的实施严格遵照赫尔辛基宣言，已通过北京阜外医院伦理委员会的审查。每例入组的参与者（及对照组家属）均签署书面知情同意书。

1.2主要仪器与试剂

Excelsior TM ES自动组织脱水机、Histocentre 3TM组织包埋机（德国Leica公司），SM2000R石蜡切片机（德国Leica公司），DP-BSW软件（日本奥林巴斯公司），电热恒温水浴箱（北京医疗器械厂），Image-Pro Plus 6.0彩色医学图文分析系统（美国Media Cybernetics公司）。

一抗兔抗人S100A4、一抗兔抗人P53、山羊抗兔二抗、DAB显色剂、PBS磷酸盐缓冲液、抗体稀释液、Tris/EDTA修复液（pH 9.0）（北京中杉金桥生物技术有限公司），天狼星红染色试剂盒（上海榕柏生物技术有限公司），mRNA原位杂交探针（武汉Stargene实验技术研发中心），Cyclin B1 mRNA原位杂交试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。S100A4靶基因的mRNA序列为：5′-GATGAGCAACTTGGACAGCAA-3′；5′-CTGGGCTGCTTATCTGGGAAG-3′。P53靶基因的mRNA序列为：5′-ACGACGGTGACACGCTTCCCTG-3′；5′-CGCTAGGATCTGACTGCGGCTC-3′。

1.3固定、取材及切片

常规取材入组心肌组织进行脱水、石蜡包埋，连续切片5张，厚度为4 μm，用于进行苦味酸天狼星红染色、免疫组化染色和mRNA原位杂交。

1.4苦味酸天狼星红染色法检测心肌纤维化程度

苦味酸天狼星红染色方法［12］：常温下（25℃）滴加苦味酸混合液、天狼星红（天狼星红1 g，饱和苦味酸100 mL，蒸馏水100 mL配制而成）适量，15～20 min后用95%乙醇洗片至无色，晾干切片，用中性树胶进行封片。

心肌间质胶原容积分数（collagen volume fraction，CVF）计算：每张切片随机选取5个视野（200×）进行拍照，用Image-Pro Plus 6.0软件分别对5个图像进行分析，计算心肌间质CVF后取均值［13］。CVF=胶原面积/全视野面积。

1.5 S100A4、P53免疫组化染色

采用PV-6000免疫组化染色方法分别对两组进行S100A4、P53免疫组化染色。一抗S100A4、P53稀释度为1∶150，PBS代替一抗作为阴性对照。

心肌细胞S100A4、P53阳性表达呈棕黄色颗粒。每张切片按等距抽样原则随机选取5个不重复视野（400×）进行拍照，用Image-Pro Plus 6.0软件分别对图像进行分析，分别测出其平均光密度、面积，计算心肌细胞内S100A4、P53阳性表达的积分光密度［14］（integral optical density，IOD）后取均值。IOD=平均光密度×面积。

1.6原位杂交检测心肌S100A4、P53 mRNA表达

原位杂交检测心肌S100A4、P53 mRNA表达，每片组织滴加20 μL杂交液［包含1 ng/μL cRNA探针，200 μg/mL葡萄糖，4×盐水枸橼酸钠（SSC）］，然后放入含50%甲酰胺湿盒中杂交16～20 h，于2×SSC洗3次，用1∶100马血清封闭后，用Avidin+Biotin-HRP孵育，最后用NBT/BCTP（450 μg/mL∶175 μg/mL）显色30 min后终止并用明胶封片。

原位杂交结果以结构清晰且着色显著高于背景，在细胞核或胞浆内出现棕黄色颗粒的为阳性，不着色或显色强度与背景无明显差别者为阴性细胞［15］。每张切片随机选取5个高倍视野（400×），统计其阳性细胞数量和着色程度，取均值。采用原位杂交值法进行阳性结果统计［16］。A表示阳性细胞数分级：0%～1%=0、1%～10%=1、10%～50%=2、50%～80%=3、80%～100%=4；B表示阳性细胞显色强度分级：0（阴性）、1（弱阳性）、2（阳性）、3（强阳性），原位杂交值=A×B。

1.7统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组心肌组织天狼星红染色结果

HCM组心肌组织CVF为0.218±0.087，较对照组的0.098±0.031高，差异有高度统计学意义（t＝4.10，P＜0.01）。

HCM组：心肌细胞呈现紫红色，多数细胞的横切面积明显肥大，心肌间质可见大量胶原纤维组织增生（图1A）。对照组：心肌细胞呈红色，细胞横切面积未见明显异常，心肌间质可见少量红色胶原纤维（图1B）。2.2两组心肌组织S100A4、P53免疫组化染色结果

图1　两组心肌组织天狼星红染色结果（200×）

HCM组心肌组织S100A4、P53的IOD值均高于对照组，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1　两组心肌组织S100A4、P53的IOD值比较（x±s）

HCM组心肌细胞内S100A4、P53阳性颗粒表达显著增多，对照组心肌细胞内S100A4、P53呈少量表达。见图2。

2.3两组心肌组织S100A4、P53原位杂交结果

HCM组心肌组织S100A4、P53的原位杂交值均高于对照组，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见表2。

HCM组心肌细胞内S100A4、P53 mRNA阳性表达显著增多，对照组心肌细胞内S100A4、P53 mRNA呈少量表达。见图3。

图2　两组心肌组织S100A4、P53免疫组化染色结果（200×）

表2　两组心肌组织S100A4、P53原位杂交值比较（x±s）

图3　两组心肌组织S100A4、P53原位杂交结果（200×）

3　讨论

心肌纤维化是HCM患者典型的病理学改变，也是一系列临床表现的病理基础，在一定程度上心肌纤维化的程度决定患者的预后［17］。本研究应用苦味酸天狼星红染色法比较两组的CVF，研究发现，HCM组胶原含量明显高于对照组，提示心肌组织胶原重构时在体内的胶原合成增强。S100A4蛋白是钙结合蛋白家族成员之一，有研究表明，S100A4蛋白参与心肌纤维化的发生，促进其心肌胶原蛋白过度降解，进而导致心脏组织重构加重［10，18］。

P53蛋白是S100A4的靶蛋白之一，与S100A4蛋白共同定位在细胞核内并相互作用，主要诱导细胞凋亡和促进分化［19］。在滑膜组织成纤维细胞上，S100A4可能与P53相互作用从而导致成纤维细胞的异常增殖［20］。有实验显示，在心肌肥大的大鼠心肌纤维化过程中，S100A4能通过调节P53相关基因，使S100A4蛋白与野生型P53蛋白发生整合，使野生型P53蛋白作用于成纤维细胞，促进其异常增殖，胶原合成增加，并在细胞外间质不断沉积，最终表现为间质纤维化［20］。

免疫组化法检测HCM患者心肌组织中S100A4、P53的蛋白表达，运用原位杂交法结果表明，HCM心肌组织中的S100A4、P53蛋白表达阳性率显著高于对照组，提示S100A4、P53的相互作用可能导致某些细胞因子作用于成纤维细胞，促使其迁移、过度增殖，进而导致胶原合成增加。目前已有研究支持心肌纤维化是HCM的原发改变而非继发于心肌肥厚之后的病理改变［21］。

S100A4、P53的相互作用与HCM心肌纤维化的关系尚未见国内外文献报道，本研究尽管在mRNA水平和蛋白水平显示HCM组S100A4、P53表达以及胶原含量变化较对照组明显增高，但S100A4、P53在HCM心肌纤维化过程中的详尽作用有待进一步研究。

［1］HughesSE.Thepathologyofhypertrophiccardiomyopathy［J］. Histopathology，2004，44（5）：412-427.

［2］Hershberger RE，Cowan J，Morales A，et al.Progress with genetic cardiomyopathies：screening，counseling，and testing in dilated，hypertrophic，and arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy［J］.Circ Heart Fail，2009，2（3）：253-261.

［3］宋金萍.63例肥厚型心肌病的心电图分析［J］.中国现代医生，2013，51（6）：138-139.

［4］Maron BJ，Maron MS.Hypertrophic cardiomyopathy［J］. Lancet，2013，381（9862）：242-255.

［5］Moreno V，Hernandez-Romero D，Vilchez JA，et al.Serum levelsofhighsensitivitytroponinT：anovelmarkerforcardiac remodeling in hypertrophic cardiomyopathy［J］.J Card Fail，2010，16（12）：950-956.

［6］Maron BJ.Hypertrophic cardiomyopathy：a systematic review［J］.JAMA，2012，287（10）：1308-1320.

［7］于瑞，王幼平，崔琳，等.心肌纤维化的发病机制及其研究进展［J］.中国现代医生，2015，53（13）：157-160.

［8］Grotterod I，Maelandsmo GM，Boye K.Signal transduction mechanisms involved in S100A4-induced activation of the transcription factor NF-kappaB［J］.BMC Cancer，2010，10：241.

［9］Schneider M，Kostin S，Strom CC，et al.S100A4 is upregulated in injured myocardium and promotes growth and survival of cardiac myocytes［J］.Cardiovasc Res，2007，75（1）：40-50.

［10］Fernandez-Fernandez MR，Veprintsev DB，Fersht AR.Proteins of the S100 family regulate the oligomerization of p53 tumor suppressor［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（13）：45-47.

［11］Spoladore R，Camici PG，Olivotto I.Pharmacological treatment options for hypertrophic cardiomyopathy：high time for evidence［J］.Eur Heart J，2012，33（14）：17-24.

［12］贾志梅，高远.心肌梗死大鼠非梗死区心肌细胞凋亡与间质纤维化的关系［J］.中国心血管杂志，2007，12（5）：467.

［13］Wolff RB.Glucosamine and chondroitin sulfate association increases tibial epiphyseal growth plate proliferation and bone formation in ovariectomized rats［J］.Clinics（Sao Paulo），2014，69（12）：847-853.

［14］Henrotin Y，Marty M，Mobasheri A.What is the current status of chondroitin sulfate and glucosamine forthe treatment of knee osteoarthritis？［J］.Maturitas，2014，78（3）：184-187.

［15］冯相平，董文彬，陈新山.冠心病猝死冠状动脉粥样硬化斑块单核细胞趋化蛋白1表达的研究［J］.中华心血管病杂志，2006，34（7）：598-601.

［16］Teunissen BE，Smeets PJ，Willemsen PH，et al.Activation of PPAR delta inhibits cardiac fibroblast proliferation and the transdifferentiation into myofibroblasts［J］. Cardiovasc Res，2007，75（3）：519-529.

［17］颜玲玲，郝晶，宋宁，等.肥厚型心肌病患者心肌纤维化指标变化及其相关性［J］.江苏医药，2014，40（22）：2691-2693.

［18］张海燕，魏宗德.心肌胶原网络重构的研究进展［J］.心血管病学进展，2003，24（5）：359-362.

［19］Berge G，Maelandsmo GM.Evaluation of potential interactionsbetweenthemetastasis-associatedprotein S100A4 and the tumor suppressor protein p53［J］.Amino Acids，2011，41（4）：863-873.

［20］CreemersEE，PintoYM.Molecular mechanisms that control interstitial fibrosis in the pressure-overloaded heart［J］. Cardiovasc Res，2011，89（2）：265-272.

［21］Tamaki Y，Iwanaga Y，Niizuma S，et al.Metastasis-associated protein，S100A4 mediates cardiac fibrosis potentially through［J］.J Mol Cell Cardiol，2013，57：72-81.

Expression and significance of S100A4 and P53 in myocardial fibrosis of hypertrophic cardiomyopathy

QI Xiaolin1HAN Jizhao2DONG Xianning3ZHAO Peng3▲
1.Medical College of Qingdao University，Shandong Province，Qingdao266071，China；2.Department of Forensic Medicine，Public Security Bureau Criminal Police Detachment of Qingdao City，Shandong Province，Qingdao 266034，China；3.Department of Pathology，Affiliated Hospital of Qingdao University，Shandong Province，Qingdao266061，China

Objective To investigate the expression of S100A4 and P53 of cardiomyocytes in patients with hypertrophic cardiomyopathy（HCM）and their correlation with myocardial fibrosis of HCM.Methods 10 cases of patients with HCM operation in Beijing Fuwai Cardiovascular Hospital from January 2013 to June 2014 were selected as HCM group.10 cases of myocardial tissues of traffic accidents and high fall to the death in Qingdao area were selected as control group.Collagen volume fraction between two groups was compared by using picrosirius red staining method.Positive expression of S100A4 and P53 in myocardial tissue between two groups were compared by using immunohistochemical method.Expression of S100A4 mRNA and P53 mRNA were detected by using in situ hybridization method.Results Collagen volume fraction of myocardial interstitial in HCM group was significantly higher than that in control group（P＜0.01）.IOD of S100A4，P53 in HCM group were significantly higher than those in control group，the differences were statistically significant（P＜0.01）.In situ hybridization value of S100A4，P53 in HCM group were significantly higher than those in control group，the differences were statistically significant（P＜0.01）.Conclusion Overexpression of S100A4 and P53 may play an important role in the process of myocardial fibrosis in HCM，may provide a new direction for the treatment of myocardial fibrosis in HCM.

Hypertrophic cardiomyopathy；Myocardial fibrosis；S100A4；P53

R542.2

A

1673-7210（2015）12（b）-0044-04

2015-09-23本文编辑：李亚聪）

山东省青岛市产学研合作引导计划（应用基础研究）（13-1-4-141-jch）。

戚晓琳（1989.10-），女，青岛大学基础医学院法医病理学专业2013级在读硕士研究生；研究方向：肥厚型心肌病与心源性猝死。