商南泉茗茶多糖的体外抗肿瘤活性

何念武，高一明

（商洛学院生物医药与食品工程学院，陕西商洛726000）

商南泉茗茶多糖的体外抗肿瘤活性

何念武，高一明

（商洛学院生物医药与食品工程学院，陕西商洛726000）

为了研究商南泉茗茶多糖体外抑瘤作用，采用MTT法检测其作用于结肠癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤细胞系后的细胞存活率、LDH法检测细胞毒性、流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡情况。结果表明，商南泉茗茶多糖对结肠癌、肺腺癌、乳腺癌等肿瘤细胞系均有不同程度的生长抑制作用，其中对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制作用最强，结肠癌次之，肺癌最弱。进一步研究表明，商南泉茗茶多糖能够使MCF-7细胞的生长周期阻滞于G0/G1期，并且有明显的诱导MCF-7细胞凋亡作用。商洛绿茶茶多糖具有明显的体外抗肿瘤活性。

商南泉茗茶；茶多糖；抗肿瘤；细胞凋亡

商洛位于陕西东南部，秦岭南麓，是陕西三大茶叶主产区之一，因位于秦岭山脉的莽岭、新开岭和郧西大梁山交汇处，属北亚热带季风型半湿润气候类型，其独特的地理位置造就了商洛绿茶色香、味浓、耐冲泡，高雅而略有华丽之感。长期以来，有关绿茶的研究主要集中在茶多酚上，茶多糖的研究则处于发展阶段，尤其是对于一些生境条件特殊、微量元素含量丰富的茶叶，对其生物活性或营养价值却少有人问津［1］。现有研究表明，茶多糖具有降血糖、降血脂以及免疫调节的功效［2］。倪德江［3］和丁仁凤［4］等通过研究证实茶多糖确实有抗氧化、降血糖的作用，但是其选取的均为常规绿茶、乌龙茶或者红茶。何念武等［1，5］就紫阳富硒茶活性成分的体外活性进行了较为系统的研究，证实紫阳富硒茶的营养价值确实较好。但对商洛茶叶的生物活性和营养价值的研究几乎没有。为此，本研究在前期分析测定了商洛绿茶中微量元素含量［6］以及商洛绿茶多糖制备工艺优化［7］的基础上，进一步对商南泉茗茶多糖的体外抗肿瘤作用进行深入研究，以期为商洛茶叶，尤其是商南泉茗茶的深度开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

商南泉茗茶，购于商南县茶叶联营公司。

1.2 方法

1.2.1 商南泉茗茶多糖的制备

参照何念武［7］的方法，采用水提醇沉法制备样品多糖并进一步以苯酚硫酸法测总糖含量［8］。1.2.2细胞实验方法

1）MTT比色法检测细胞存活率

取生命力旺盛的对数生长期细胞，用含10%胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）的细胞培养液制成2×104个/mL的单细胞悬液，按照每孔150 μL的量接种到96孔细胞培养板上，在37℃的温度下，5%CO2培养箱（型号：Midi40，美国Thermo公司）中培养24 h后，弃去培养液，重新加入150 μL的培养液和10 μL不同浓度的样品多糖溶液（0，50，100，150，200 μg·mL-1），阴性对照为生理盐水和细胞培养液，继续孵育48 h后，每孔加入15 μL 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT，浓度为5 mg·mL-1），37℃继续孵育4 h后加入二甲亚砜终止反应，在酶标分析仪（型号：深圳雷杜RT6000）490 nm处测定OD值，每个处理设三个重复。按公式（1）计算细胞存活率［5，9-11］：

2）细胞毒性分析

采用乳酸脱氢酶（LDH）法分析商南泉茗茶多糖对肿瘤细胞的细胞毒性作用。前期细胞培养及后期多糖样品处理与MTT法一致，不同之处在于继续培养一定时间后，直接离心、取上清，按LDH试剂盒（购于南京建成生物工程研究所）说明书操作进行，在酶标分析仪（深圳雷杜RT6000）450 nm处测定OD值，每个处理设三个重复。按公式（2）计算细胞上清液中LDH活性。

3）流式细胞术检测细胞周期分布

取对数生长期细胞，用含10%胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）的细胞培养液制成2×105个/mL的单细胞悬液，按照每孔1 mL的量接种到6孔细胞培养板上，培养24 h后，分别加入0，50，100，200 μg·mL-1的商南泉茗茶多糖样品溶液，继续孵育48 h后，用0.25%胰酶消化液进行消化，离心，收集细胞，在4℃冰箱以70%乙醇固定12 h以上。固定后的细胞用PBS洗两遍并制成细胞悬液，加入PI染液（最终质量浓度为50 μg·mL-1），37℃避光温育30 min，300目尼龙网滤过，流式细胞仪（BD FACSCalibur）上计数20 000个细胞，测定细胞各期DNA水平，分析细胞周期分布［5，11］。

4）流式细胞仪（FCM）测定细胞凋亡率

细胞培养及样品处理同周期分布检测，区别在于培养48 h后，离心收集细胞，然后加入相关凋亡检测试剂。按Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（购于上海贝博生物科技有限公司）说明进行操作，随后再流式细胞仪（GUAVAeasyCyteTM8HT，美国密理博公司）上计数10 000个细胞，计算细胞凋亡率［5，11］。

1.2.3 数据处理

所有数据均采用M±SD，结果用SPSS18.0统计分析。

2 结果与分析

2.1 商南泉茗茶多糖对细胞存活率的影响

从图1中可以看出，商南泉茗茶多糖作用于不同肿瘤细胞系之后，伴随着茶多糖质量浓度的不断增加，细胞存活率明显下降，呈现出良好的剂量-效应关系。当样品多糖浓度在200 μg·mL-1时，结肠癌（LoVo）细胞存活率48.71%，肺癌（A549）存活率为51.37%，乳腺癌（MCF-7）存活率为38.71%。三种细胞中A549存活率最高，LoVo存活率次之，MCF-7存活率最低，结果表明，商南泉茗茶多糖对MCF-7细胞的增殖抑制作用最强。

此外，通过对水提醇沉法制备的茶多糖总糖含量测定发现，其多糖含量能够达到68.7%，足以说明主要是茶多糖在发挥抑瘤作用。

图1 商南泉茗茶多糖对不同肿瘤细胞的存活率

2.2 商南泉茗茶多糖对不同细胞LDH释放量的影响

乳酸脱氢酶（LDH）是一种稳定的糖酵解蛋白质酶，存在于生命有机体所有组织、细胞的胞质中，一旦细胞膜受到外界刺激并受到损伤，LDH即被释放到细胞外，LDH催化乳酸形成丙酮酸盐和四唑盐类反应形成紫色的结晶物质，可在酶标仪450 nm处进行检测。从而通过检测药物作用后细胞培养上清液中LDH的活力，可以间接的判断药物对肿瘤细胞的损伤程度［10］。

从图2中可以看出，当样品浓度从0增加到200 μg·mL-1时，各细胞系的乳酸脱氢酶释放量均有不同程度的增加，说明商南泉茗茶多糖能促使肿瘤细胞释放出更多的LDH，从而间接发挥细胞毒作用。在样品多糖浓度为200 μg·mL-1时，结肠癌细胞LDH释放量为708.75 U·L-1、肺癌细胞释放量为969.17 U·L-1、乳腺癌释放量为931.67 U·L-1，三种细胞中A549的释放量最高，MCF-7次之，LoVo最弱。

图2 商南泉茗茶多糖作用于不同细胞系的LDH活性

综合MTT和LDH实验结果，本研究继续对MCF-7细胞进行深入的抗肿瘤机制探究。

2.3 商南泉茗茶多糖对MCF-7细胞周期分布的影响

由图3中可以看出，不同剂量的茶多糖样品作用于MCF-7细胞后，G0/G1期细胞DNA含量明显增高，G2/M期DNA含量不断减少，而S期DNA含量变化不大，说明样品多糖作用于MCF-7细胞之后使其生长周期阻滞于G0/G1期。

图3 商南泉茗茶多糖对MCF-7细胞周期分布的影响

2.4 商南泉茗茶多糖诱导MCF-7细胞凋亡情况

2.4.1 多糖样品诱导MCF-7细胞凋亡结果

由图4可以看出，不同质量浓度的商南泉茗茶多糖作用于MCF-7细胞之后，都产生了一定的诱导细胞凋亡作用，包括空白对照也有近1.4%的凋亡率（图4A），这可能是在细胞处理过程中产生的少许细胞碎片，或者是后期数据处理有所欠缺所致。如图4D所示，在200 μg·mL-1时，诱导MCF-7细胞早期凋亡率为56.62%，晚期凋亡率为12.36%。由此可见，早期凋亡率最高，结果表明商洛绿茶有较明显的促凋亡作用。

2.4.2 茶多糖样品诱导MCF-7细胞凋亡率

从图5中可以看出，随着样品多糖质量浓度的增加其诱导MCF-7细胞凋亡率呈快速增长的态势。样品诱导细胞凋亡率依次为1.4%，14.1%，31.0%，68.9%。在200 μg·mL-1时细胞早期凋亡率达到56.62%，晚期凋亡率为12.36%，表明在200 μg·mL-1时样品诱导MCF-7细胞凋亡率非常明显，与对照相比，差异极显著（P＜0.01）。

图4 茶多糖诱导MCF-7细胞凋亡作用

3 结论与讨论

商南泉茗茶多糖具有明显的体外抗肿瘤活性。在体外细胞模型上对LoVo、A549、MCF-7等均有不同程度的增殖抑制作用。同时，又具有较好的诱导MCF-7细胞凋亡作用。

图5 不同浓度茶多糖诱导MCF-7细胞凋亡率

现代研究表明，茶多糖是茶叶中治疗糖尿病的主要药理成分，一般由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、核糖、半乳糖等单糖组成，本文主要是验证商南泉茗茶多糖的细胞增殖抑制作用，故对其单糖组成还需进行研究。一般而言，粗老茶多糖含量较高，等级低的茶叶中茶多糖含量高。在治疗糖尿病方面，粗老茶比嫩茶效果要好［1］。因而，在材料选择的时候宜选取粗老茶叶。

此外，研究发现人体内每天都会有一些细胞死亡，又有一些新的细胞产生，从而维持整个机体的正常运转。对于这些细胞死亡的现象，有些是病理性的，有些则是生理性的，因而这也成为生物医学界的研究热点问题。目前，关于细胞死亡的方式学界普遍认为主要是坏死和凋亡，前者发现较早，后者则是近些年来才被发现的。不管是细胞凋亡，还是细胞坏死，其最终结果都非常相似，但它们的死亡过程和现象却有着极大的差别［1，5］。茶多糖是茶叶中的主要活性成分，对于其抗肿瘤活性研究也尤为重要。本文就商南泉茗茶多糖体外抗肿瘤活性进行了较为深入的探讨，研究表明，在体外细胞模型上对LoVo、A549、MCF-7等均有不同程度的增殖抑制作用。同时，又具有较好的诱导MCF-7细胞凋亡作用。

茶多糖是从茶叶中提取分离出来的一种蛋白多糖复合物，具有显著的生物活性，有防癌和降血脂，清热解毒，消肿止痛，活血通络的功效［12］，既可用于医药工业，也可用于食品行业，是一种很好的功能性饮料。因此，针对茶多糖功能饮品的开发利用具有广阔的前景，尤其是那些生境条件特殊的茶叶，对进一步研究开发以其为原料的功能性饮品或保健药物，提供一定理论依据。

［1］何念武.紫阳富硒绿茶茶多糖与茶多酚抗肿瘤药理作用研究［D］.西安：陕西师范大学，2012：1-5.

［2］高英霞.茶多糖的提取及其药理作用研究概况［J］.山东工业技术，2013，33（11）：152-153.

［3］倪德江，陈玉琼，谢笔钧，等.绿茶、乌龙茶、红茶的茶多糖组成、抗氧化及降血糖作用研究［J］.营养学报，2004，26（1）：57-60.

［4］丁仁凤，何普明，揭国良.茶多糖和茶多酚的降血糖作用研究［J］.茶叶科学，2005，25（3）：219-224.

［5］He N W，Shi X L，Xhao Y，et al.Inhibitory effects and molecular mechanisms of selenium-containingtea polysaccharidesonhumanbreastcancerMCF-7 Cells［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2013，61（3），579-588.

［6］何念武.用微波消解-FAAS法测定商洛绿茶中微量元素［J］.江西农业学报，2014，27（6）：78-81.

［7］何念武.水提醇沉法制备商南泉茗茶茶多糖的研究［J］.商洛学院学报，2013，27（6）：78-81.

［8］张居作，许巧玲，徐君飞.苦瓜多糖含量的苯酚硫酸法检测研究［J］.食品研究与开发，2015，36（5）：82-85.

［9］吕青，呈中，襄淑兰，等.MTT法检测乳腺癌细胞对化疗药物敏感性的研究［J］.中国医药导报，2010，7（3）：28-29.

［10］韩笑，吴光杰，李玉萍，等.马齿苋多糖对细胞存活率的影响及其毒性测定方法的比较研究［J］.天然产物研究与开发，2015，27（2）：344-349.

［11］He N W，Yang X B，Jiao Y D，et al.Haracterisation of antioxidant and antiproliferative acidic polysaccharides from Chinese wolfberry fruits［J］.Food Chemistry，2012，133（3）：978-989.

［12］汪东风，谢晓峰，王银龙.茶叶多糖及其药理作用研究进展［J］.天然产物研究与开发，1996，8（1）：63-68.

（责任编辑：李堆淑）

In Vitro Antitumor Activity of Tea Polysaccharide in Shangnan Quanming

HE Nian-wu，GAO Yi-ming
（College of Biopharmaceutical and Food Engineering，Shangluo University，Shangluo726000，Shaanxi）

In order to research on the antitumor activity of Shangnan Quanming tea polysaccharide in vitro. MTT method is chosen to detect survival rate，lactate dehydrogenase detection cell（LDH）method was used to detect cell toxicity，flow cytometry（FCM）analysis of the cell cycle，cell apoptosis was detected by FCM method in Shangnan Quanming tea polysaccharide in vitro anti-colon cancer（LoVo），lung cancer（A549），breast cancer（MCF-7）.The results show that，Shangnan Quanming tea polysaccharide on LoVo，A549，MCF-7 growth inhibition were added，which the strongest inhibitory effect on breast cancer，colon cancer times，lung cancer.Through further study found，tea polysaccharide can cause cell cycle arrest in breast cancer cells in G0/G1phase，and there were obvious apoptosis.Shangnan Quanming tea polysaccharide has significant in vitro antitumor activity.

Shangnan Quanming tea；tea polysaccharide；antitumor；apoptosis

TQ914.1

A

1674-0033（2015）04-0051-05

10.13440/j.slxy.1674-0033.2015.04.014

2015-05-20

商洛学院科研基金项目（13SKY-FWDF007）

何念武，男，陕西洛南人，硕士，讲师