抗CD47胞外区骆驼多克隆抗体的制备及鉴定

贾二坷 冯亚宁 李江伟

（新疆大学生命科学与技术学院　新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐　830046）

抗CD47胞外区骆驼多克隆抗体的制备及鉴定

贾二坷 冯亚宁 李江伟

（新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐830046）

验证人CD47蛋白能否在新疆双峰驼中产生高滴度抗体；为制备高亲和力的抗CD47纳米抗体提供实验依据。 构建CD47胞外区原核表达载体，诱导表达及纯化CD47蛋白，免疫新疆双峰驼。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和Western blot分别检测骆驼多克隆抗体的效价及与CD47蛋白特异性结合活性。结果显示，成功构建CD47胞外区原核表达载体，获得纯度大于90%的CD47蛋白，表达纯化的CD47重组蛋白可与抗CD47单抗B6H12.2特异结合；ELISA测定CD47重组蛋白免疫骆驼7次后，抗CD47多克隆抗血清的效价至少达到1∶200 000，免疫印迹检测表明抗CD47骆驼抗血清与CD47重组蛋白、Jurkat和Raji细胞表面表达的CD47均能特异结合。 重组人CD47蛋白可以在骆驼体内激发高滴度抗体反应。

CD47；多克隆抗体；新疆双峰驼；纳米抗体

肿瘤免疫逃逸是阻碍抗肿瘤免疫治疗的一大障碍，巨噬细胞通过其表面表达的Fc受体对包括肿瘤在内的靶细胞行使吞噬作用，是抗体发挥细胞毒作用（antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）的主要效应细胞。在抗肿瘤免疫反应中，巨噬细胞发挥吞噬作用涉及巨噬细胞识别靶细胞表面的促吞噬（“eat me”）和抗吞噬（“don’t eat me”）信号［1］。巨噬细胞及树突状细胞表面表达信号调节蛋白α（Signal regulatory protein alpha，SIRPα），与一种广泛表达的跨膜蛋白CD47结合［2］，使得巨噬细胞启动抗吞噬信号，从而避免了对正常细胞的攻击。

CD47又叫整合素相关蛋白（integrin associated protein，IAP），是一个50 kD的膜表面蛋白，表达广泛，属于免疫球蛋白超家族成员，具有IgV样胞外结构域和5个跨膜区以及1个短的胞质尾［2］。CD47可以结合整合素和凝血栓蛋白-1（thrombospondin-1，TSP-1），参与多种生理和病理过程，包括细胞迁移［3］，T细胞和DC的激活［4］以及轴突发育、细胞凋亡、增殖和炎症等。最近一系列研究报道抗CD47单克隆抗体可以阻断CD47-SIRPα信号通路，激活巨噬细胞的吞噬作用，在白血病和淋巴瘤以及肿瘤和实体瘤肿瘤动物模型中，都取得了良好的治疗效果［5-10］，表明CD47可以作为肿瘤治疗的理想靶点。

目前抗CD47的抗体研究主要集中在单克隆抗体。然而，大分子的单克隆抗体具有组织（如实体瘤）的穿透能力差、且难以结合位于细胞表面的蛋白裂隙中的表位（如受体和配体结合部位）的缺点。另外还有生产和储存成本高、价格昂贵等因素限制了这类药物在临床的广泛使用。

纳米抗体是1993年发现的一种仅存在于骆驼科动物中的天然重链抗体的可变区结构（variable domains of the HCAb，简称为VHH）［11］，其分子量为15 kD，仅为全分子抗体的1/10，分子大小在纳米级，是目前可以得到的具有完整抗体功能的最小分子片段。这种纳米抗体的抗原结合区具有与常规单抗不同的结构［12］，在空间上呈突出的指状结构，因此可以结合一些常规抗体无法接近的抗原表位，如位于受体裂隙中的配体结合部位［13］。这使得这类抗体具有较大的应用价值。

本研究为验证CD47重组蛋白能否在骆驼中激发高滴度的特异抗体，从而为构建骆驼淋巴细胞重链抗体基因表达文库提供材料，我们采用原核表达的人CD47胞外区片段作为抗原免疫骆驼，并检测骆驼免疫CD47后的体液免疫水平，以及骆驼多克隆抗体与Jurkat、Raji（均高表达CD47蛋白［7，14］）细胞表面表达的CD47蛋白的特异结合，为今后制备抗CD47的纳米抗体，进而研究其抗肿瘤作用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 CD47的cDNA购自Sino Biologicai Inc；DH5α感受态细胞，BL21（DE3）感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司。雄性新疆双峰驼一头，1年龄，本地区饲养。Raji细胞购自长沙赢润生物技术有限公司，Jurkat细胞由暨南大学生命科学技术学院馈赠。

1.1.2 试剂 Ex Taq polymerse，限制性内切酶Bam H Ⅰ、Eco RⅠ，T4 ligation 购自宝生物工程（大连）有限公司；质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；Ni SepharoseTM6 Fast Flow购自GE Healthcare公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自Life Science公司，Bradford法蛋白定量试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；Mouse anti-CD47 IgG（B6H12）购自BD公司（中国）；Rabbit anti-Llama IgG（H&L），Affinity Pure购自ImmunoReagents，Inc；抗His标签鼠源单克隆抗体，山羊抗鼠IgG（H&L）-HRP，山羊抗兔IgG（H&L）-HRP购自康为世纪；完全弗式佐剂及不完全弗式佐剂购自Sigma（中国）；细胞膜抽提试剂盒购自碧云天公司；BeyoECL显色液购自Beyotime公司；其他常规试剂为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 CD47胞外区的扩增 将含有CD47的cDNA的质粒转化至DH5α感受态细胞，通过培养细菌，提取质粒，作为PCR扩增CD47胞外区基因序列扩增的模板。根据CD47胞外区碱基序列设计引物：P1：5'-CCGGATCCCAGCTACTATTTAATAAAAC-3'（下划线为含有Bam HⅠ酶切位点）；P2：5'-CCCT CGAGGATTTTATAGCACAACAAAGT-3'，（下划线为Eco RⅠ酶切位点）。PCR反应体系：ddH2O 13.5 μL，dNTP 2 μL，10×Ex Taq buffer 2 μL，P1 0.3 μL，P2、0.3 μL，TaKaRa Ex Taq 0.3 μL，质粒：1 μL，共20 μL。PCR反应条件：95℃ 5 min；95℃ 35 s，61℃ 35 s，72℃ 35 s，35个循环；72℃ 7 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化。

1.2.2 原核表达质粒的构建和鉴定 回收纯化的目的片段用 Bam HⅠ和Eco RⅠ限制性内切酶进行双酶切。同时活化DH5α-pET30a菌种，挑取单克隆，提取质粒，用同样的限制性内切酶酶切pET30a。回收酶切的目的片段和载体经T4连接酶16℃过夜连接。最后连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞。挑取转化的阳性克隆提取质粒，进行酶切和基因测序鉴定，重组质粒命名为 DH5α-pET30a-CD47。

1.2.3 CD47蛋白的原核表达纯化及鉴定 将测序正确的重组质粒转化至BL21（DE3）感受态细胞，37℃培养过夜；次日扎取单克隆，菌液PCR鉴定，按1%接菌到10 mL含有终浓度为50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，220 r/min震荡4 h；加IPTG使终浓度为1 mmol/L诱导4 h，取样经SDS-PAGE检测蛋白的表达。同时用Western blot检测诱导所得蛋白：一抗分别为抗His标签鼠源单克隆抗体，Mouse anti-CD47 IgG，稀释比例均为1∶2 000；二抗为山羊抗鼠IgG（H&L）-HRP；稀释比例为1∶5 000，ECL显色，Las4000检测。大量培养和诱导BL21-pET30a-CD47，用镍亲和层析柱纯化。

1.2.4 CD47蛋白免疫新疆双峰驼 纯化的CD47蛋白经Bradford法测定浓度约为0.9 mg/mL。用纯化的蛋白免疫新疆双峰驼：每次免疫的量为0.44 mg，第一次免疫使用等体积的完全弗式佐剂，之后的6次加强免疫时加等量的不完全弗式佐剂，每14 d免疫1次，共免疫7次，采集免疫前和免疫后的骆驼血清，-20℃保存备用。

1.2.5 ELISA检测多克隆抗体的效价 rCD47蛋白在96孔板中4℃包被过夜。对免疫前、后的骆驼血清，进行倍比稀释，作为一抗测定骆驼血清抗CD47蛋白的血清效价。二抗为兔抗美洲驼IgG（H&L），稀释比例为1∶3 000；采用HRP-羊抗兔IgG（H& L）作为检测抗体（稀释比例为1∶5 000）。底物为TMB，采用ECL检测，酶标仪中测定540 nm吸光值。

1.2.6 Western blot检测多克隆抗体与细胞表面表达CD47的结合 将Jurkat细胞接种于含10% FBS的1640培养基中，37℃，5.0% CO2培养。收集3×107个Jurkat细胞，利用细胞膜提取试剂盒抽提Jurkat细胞膜蛋白。用分离胶浓度为12%的SDS-PAGE分离蛋白，使用PVDF膜转膜，转膜条件为90 V，1 h。骆驼源多克隆抗体、Mouse anti-CD47 IgG（B6H12.2）为 一 抗；Rabbit anti-Llama IgG（H&L）、 山 羊 抗鼠IgG（H&L）-HRP分别为二抗；山羊抗兔IgG（H&L）-HRP为三抗。ECL显色，Las4000检测。

2 结果

2.1 PCR扩增CD47胞外区基因片段

将pGEM-CD47质粒作为模板，用CD47特异引物扩增该基因片段。CD47胞外区片段大小为363 bp（图1）。

图1 PCR扩增CD47胞外区基因片段

2.2 重组质粒pET30a-CD47的构建与鉴定

用限制性内切酶Bam HⅠ和Eco RⅠ对重组质粒pET30a-CD47进行双酶切，出现一条线性载体条带和一条363 bp的目的条带（图2），将酶切鉴定正确的重组质粒测序，结果表明插入的目的基因核苷酸序列完全正确。

图2 重组表达质粒双酶切分析

2.3 CD47的原核表达及融合蛋白的纯化

将阳性克隆的重组子小量扩增后，用1 mmol/L的IPTG诱导，得到22 kD的重组蛋白（图3），蛋白大小符合预期分子量。且经Western blotting检测（图4-B），鉴定所得蛋白为CD47。进一步大量诱导菌体，经超声破碎后，检测到重组蛋白以包涵体形式表达。沉淀用含4 mol/L尿素的Tris-HCl溶解，通过镍亲和层析之后，重组蛋白纯度可达90%以上。

图3 SDS-PAGE检测CD47蛋白表达

2.4 CD47蛋白的鉴定

通过Western blotting检测重组蛋白CD47。结果（图4-A）显示，纯化的CD47蛋白与抗His标签的单克隆抗体特异结合。经1 mmol/L IPTG诱导4 h的菌体总蛋和纯化的CD47蛋白均可与Mouse anti-CD47 IgG结合（图4-B），而不与未诱导的菌体总蛋白结合。

图4 Western blotting检测CD47蛋白

2.5 抗体效价的测定

利用重组蛋白免疫新疆双峰驼，获得了抗CD47的骆驼源多克隆抗体。取免疫前的血清和最后一次加强免疫后第4天收集的血清，通过ELISA测定抗体的效价。抗原CD47蛋白的包被量为5 μg/孔；骆驼来源的血清按1×103、2×103、1×104、2×104、1×105和2×105梯度稀释。结果（图5）表明骆驼来源的抗体效价至少为1∶200 000。

图5 ELISA测定骆驼来源抗CD47抗体的效价

2.6 Western blotting鉴定骆驼多克隆抗体与CD47

的结合

Western blotting结果（图6）表明，与抗CD47单抗B6H12.2一样，骆驼多克隆抗体既能与重组的CD47蛋白结合，也能与Jurka、Raji细胞表面CD47蛋白特异性结合。而未免疫的血清（图6-A泳道1，6-B泳道3和4）与重组CD47和细胞表面表达的CD47均不结合。

图6 Western blotting检测骆驼多抗与rCD47（A）和细胞表面CD47蛋白（B）的结合

3 讨论

新疆双峰驼属于骆驼科骆驼属，该属目前仅存两种。除广泛分布于我国新疆、青海、内蒙等地以及蒙古的双峰驼外，还有分部于中亚地区和非洲北部的单峰驼。由于新疆双峰驼饲养方式多为放养，给免疫操作带来了困难。另外，根据我们和国外研究者的经验，并不是所有抗原都能在骆驼中激发高滴度抗体反应。Daley［15］发现，感染Parelaphostrongylus tenuis寄生虫的美洲驼不能产生保护性的抗体反应。为了获得高水平的抗CD47骆驼IgG，尤其是重链亚型的抗体，有必要分析其体液免疫水平。本研究采用重组CD47胞外区蛋白，经过对骆驼7次免疫后，在骆驼外周血中检测到了高滴度的抗CD47 IgG抗体（1∶200 000），表明免疫策略是成功的，重组表达的CD47抗原在骆驼中具有较强的免疫源性。

CD47为5次跨膜蛋白，其氨基端116个氨基酸为胞外Ig样结构域，是结合SIRPα的主要区域［16］，该区域也是抗体结合的主要位点。因此，本研究克隆和表达了这部分序列，作为免疫用抗原。但在最初大肠杆菌中表达人CD47胞外区蛋白时，表达量极低甚至不表达。考虑到大肠杆菌密码子的偏好性，我们对CD47的密码子进行了优化。优化后的CD47基因在大肠肝菌中获得了较高水平的表达，满足了免疫骆驼的要求。另外，尽管骆驼属于体型高大的动物，但国外报道用于免疫的抗原的剂量最少可低至50 μg/次［17］。本实验采用抗原剂量为0.44 mg/次，皮下单点或多点注射，激发了较高的抗体反应。今后在免疫骆驼时还可以对免疫用抗原剂量进行优化，以最大限度减少抗原的用量，并获得高水平的抗体反应。

4 结论

本研究采用原核表达，并经过密码子优化后的人CD47胞外区抗原可以在骆驼体内诱导高滴度的抗体反应，免疫后的新疆双峰驼血清特异性结合CD47蛋白，可用于后续抗体基因文库的构建。免疫印迹检测表明抗CD47骆驼抗血清也可与Jurkat和Raji细胞表面高表达的CD47特异结合，表明新疆双峰驼是获得重链抗体的可靠宿主，也是制备重链抗体库的良好材料。

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（责任编辑 马鑫）

Preparation and Identification of Polyclonal Antibody Against CD47 Derived from Camel

Jia Erke Feng Yaning Li Jiangwei
（Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi830046）

This work aims to verify whether or not recombinant human CD47 would induce high antibody response in Xinjiang Camelus bactrianus， and provide the experimental evidences for preparing anti-CD47 nanobody of high affinity. The gene segment of CD47 extracellular region was amplified by PCR and ligated into pET30a plasmid， and a prokaryotic expression vector was constructed. The recombinant CD47 protein （rCD4） was expressed by IPTG induction and purified with Ni-affinity chromatography. A male C. bactrian camel was immunized with purified rCD47 antigen. The enzyme-linked immunosorbent （ELISA） and Western blotting were applied to assay the titer of polyclonal antibody and the specific binding to CD47 protein. The purified rCD47 of high purity （90%） from prokaryotic expression vector of CD47 extracellular region bound specifically with B6H12.2 of anti-CD47. The ELISA results revealed that the titer of polyclonal anti-CD47 antibody in camel at least reached 1:200000 after the 7th immunization. The Western blotting results demonstrated that camel antiserum of resisting CD47 specifically bound with rCD47， and CD47 on membrane of Jurkat and Raji cells. In conclusion， the anti-CD47 polyclonal antibodies of high titer were raised in camel and it lay a promising foundation for the future experiment.

CCD47；polyclonal antibody；Bactrian camel；nanobody

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.029

2014-11-24

国家自然科学基金项目（31370933）

贾二坷，女，硕士，研究方向：生物化学与分子生物；E-mail：erkejia@sina.com

李江伟，男，博士，教授，研究方向：分子免疫学；E-mail：jwli67@sina.com