不同品种药用菊花绿原酸和黄酮类溶出规律的研究

贾国梁1 杨 茜2

【摘 要】目的：通过建立HPLC法测定3种菊花中2种有效成分，并用此方法探讨有效成分的溶出规律。方法：采用Hypersil BOS C18 色谱柱（4.6×250 mm，5 ?m）；以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱，流速为1.0 ml/min；柱温为25 ℃；紫外-可见光检测器，检测波长为210 nm。结果：在20min 内菊花中绿原酸和黄芩苷能与其他成分完全分离，绿原酸先溶出。结论：本实验采用HPLC法，对绿原酸和黄芩苷的分离效果好，灵敏度高，准确，可用于多种菊花样品的分析测定。

【关键词】HPLC；菊花；溶出规律

菊花（Flos Chrysanthemi）为菊科植物菊（Chrysanthemum morifolium Ramat）的头状花序，具有疏风清热、明目解毒的功效，主要治疗头痛、眩晕、目赤、心胸烦热、疔疮、肿毒等症。黄酮类化合物为菊花最主要的有效成分之一，在生命科学，制药，食品等领域都具有非常重要的意义[1-2]。目前文献报道[3-5]的菊花的黄酮主要有：香叶木素、木犀草素、芹菜素、香叶木素7-O-β-D葡萄糖苷、木犀草素7-O-β-D葡萄糖苷、金合欢素7-O-β-D葡萄糖苷、刺槐苷、金合欢素7-O-（6-O-乙酰）-β-D葡萄糖苷、金合欢素；多酚类化合物主要为绿原酸。

本研究采用水煎煮法对不同煎煮时间点的不同品种菊花中主要活性物质进行提取，利用高效液相色谱法（HPLC）检测菊花中黄芩苷及绿原酸的含量，进一步将各个时间点的溶出含量绘制成曲线，通过比较分析得出菊花的最优煎煮时间，得出菊花的溶出规律，为菊花科学使用提供实验参考依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Waters e2695D alliance液相色譜仪；AB135-S型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；Waters 1525 二元梯度泵；KQ5200B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；

1.2 试剂

绿原酸对照品购自中国食品药品检定研究院（批号为110753-200413），菊花购于浙江中医药大学饮片厂；乙腈（色谱纯，美国TEDIA有限公司）；磷酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；去离子水（18.2MΩ）

2 实验方法

2.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Hypersil BOS C18 色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈（A）︰0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱，0～55min（90%～75%），55～75min（75%～60%），75～76min（60%～90%）；检测器：紫外-可见光检测器；检测波长（λ）：210nm；

柱温：25℃，流速：1mL/min；结果表明，在此色谱条件下，样品分离效果好，其它成分对绿原酸和黄芩苷的测定无干扰，理论塔板数按绿原酸和黄芩苷计，均不低于3000。

2.2 对照品溶液的制备：

精密称取绿原酸对照品3.2mg，精密称取黄芩苷对照品2.06mg，分别置于2mL棕色容量瓶，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品一级母液；取绿原酸一级母液1mL（以及黄芩苷一级母液1mL），于10mL容量瓶，甲醇稀释至刻度，既得对照品混合母液，置于冰箱保存备用。临用前将对照品混合母液按不同比例稀释（稀释1、2、4、8、16、32倍），得到绿原酸质量浓度为160?g/mL、80?g/mL、40?g/mL、20?g/mL、10?g/mL、5?g/mL，及黄芩苷质量浓度为103.00?g/mL、51.50?g/mL、25.75?g/mL、12.88?g/mL、6.49?g/mL、3.24?g/mL的系列对照品溶液，过0.45?m微孔滤膜，收集续滤液于液相进样瓶中待进样。

2.3 供试品溶液的制备：

称取3g不同产地菊花样品，分别置于1000mL烧杯，各加入400mL蒸馏水，加盖，电炉加热（先武火至沸，后用文火保持微沸），沸腾后立即取样（记为0min），分别于0min，1min，2min，3min，5min，10min，15min，20min，30min，40min各取样一次。每次取样1mL，同时向烧杯中补入1mL等量开水并记录汤液量。样品溶液过0.45?m微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。

3 实验结果及方法学考察

3.1 实验结果

根据上述的操作步骤，得到菊花绿原酸和黄芩苷色谱图。下图1为标准样品色谱图，图2为各个供试品菊花水煎液的色谱图。

图1 标准品色谱图

1 绿原酸 2 黄芩苷

图2 单煎（20min样品）A 贡菊 B 滁菊 C 杭白菊

1 绿原酸 2黄芩苷

3.2 线性关系试验：

精密吸取对照品溶液，按上述“2.1”项下色谱条件进行测定，每次进样10?L，重复3次，以峰面积Y为纵坐标，进样量（?g）X为横坐标，进行线性回归制作标准曲线。绿原酸和黄芩苷标准曲线分别为绿原酸Y=1359135X-1637，r=0.9999；黄芩苷：Y=618223X-14986，r=0.9997。结果表明，2种成分在各自浓度范围内线性关系良好。

3.3精密度试验

精密吸对照品溶液，按上述色谱条件，连续进样6次，每次10μl，测定峰面积。绿原酸的平均峰面积为269452.50，RSD=0.63 %，黄芩苷的平均峰面积为64543.67，RSD=0.46%，结果表明仪器精密度良好。

3.4 稳定性试验

取新制备的供试品溶液（以贡菊为例），分别在于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样，每次进样10?L，测定峰面积，计算RSD。绿原酸的平均峰面积为464834.67，RSD=0.52%，黄芩苷的平均峰面积为192104.33，RSD=0.12 %，结果表明供试品在24小时内稳定。

3.5 重复性试验：

称取同一批次菊花（以贡菊为例）3g六份，在同一火候、加水量、煎煮方法及取样时间（10min）制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行测定，每次进样10?L，平行进样3次，测定峰面积。计算绿原酸RSD=1.41%，黄芩苷RSD=1.34 %，结果表明本测定方法具有良好的重复性。

3.6 三批样品含量测定

取3种菊花，按供试品溶液的制备方法，每批制备3组。按上述色谱条件，分别进样10 μl，测定峰面积，计算含量（图3，4所示）。

图3 3种菊花中绿原酸含量

图4 3种菊花中黄芩苷含量

4 结论

本法采用HPLC法测定菊花中2种成分的溶出规律，对样品灵敏度高，分离效果好，重现性强，操作简便在210nm下可以较好地检测到绿原酸和黄芩苷，与其他成分均达到基线分离，符合含量测定的要求。不同产地的菊花其綠原酸和黄芩苷含量有所不同，实验表明滁菊中绿原酸含量最高，贡菊次之，杭白菊最少，贡菊中黄芩苷含量最高，滁菊次之，杭白菊最少，说明产地能影响其化合物的含量。绿原酸溶出规律为贡菊在5min时已达到最高的溶出，而滁菊和杭白菊分别在15min时溶出最多。黄芩苷的溶出规律为贡菊在4min时溶出最多，而后缓慢下降，而滁菊和杭白菊上升较为缓慢在15min时达到溶出最大值。

5讨论

5.1检测波长和流动相的选择

由绿原酸，黄芩苷对照品的紫外吸收光谱可知，绿原酸在328nm处有最大吸收，黄芩苷在278nm处有最大吸收，所以选择波长为210nm处检测。绿原酸为苯丙酸类化合物，黄芩苷为黄酮类化合物，流动相的酸性和极性对二者影响有较大差异。对比二者结构，控制流动相为弱酸性可抑制其解离，同时可改善峰形。

5.2 与其他色谱法的比较

利用薄层扫描方法来检测菊花中有效成分含量，不能有效的检测其含量，利用灵敏度更高的HPLC分析方法能得出不同产地的菊花其含量有所差别。

参考文献：

[1]王岩，谢媛媛，孙嘉鸿，王瑞杰，袁丹.菊花提取物中总黄酮与总有机酸的含量测定[J].沈阳药科大学学报，2011，02：124-129.

[2]李勉，刘广河，李沿涛，王萌，王雁.HPLC法测定开封培育菊花中绿原酸的含量[J].河南大学学报（医学版），2011，01：39-41.

[3]邵清松，郭巧生，李育川，王佩佩.药用菊花HPLC图谱分析及其模式识别研究[J].中草药，2011，11：2330-2334.

[4]崔兰冲，李小芩，韩莹，李发美.HPLC测定野菊花中蒙花苷与木犀草素的含量[J].中国中药杂志，2007，01：33-35.

[5]刘伟，邢志霞，陈志红，王东.怀菊花HPLC指纹图谱的研究[J].药物分析杂志，2007，08：1178-1181

[6]高学玲，贺曼曼，邹敏亮，岳鹏翔，查芳芳.不同品种药用菊花中游离糖类及游离氨基酸含量的HPLC分析[J].天然产物研究与开发，2012，05：639-643

[7]敬应春，郭美兰，蔡国琴，张聪，邱明丰.野菊花反相高效液相色谱指纹图谱的建立及品质评价[J].国际药学研究杂志，2012，03：246-250.