利用PCR技术鉴别畜禽肉中鸭源性成分研究

张晶鑫 高玉时 樊艳凤 唐修君 贾晓旭 顾荣 陆俊贤

摘要 [目的] 建立一種快速准确的鸭源性成分检测方法。[方法]分别以线粒体16S rRNA 基因和COⅠ基因序列为靶位点设计鸭特异性引物，以常见畜禽肉（羊肉、牛肉、猪肉、兔肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉）DNA为模板，进行PCR扩增，检测引物的特异性和灵敏度。[结果]筛选的引物能够有效地对鸭源性成分进行检测，方便简洁，灵敏度较高。[结论]该方法能够快速有效地鉴别畜禽肉中鸭源性成分。

关键词 鸭源性成分；16S rRNA 基因；COⅠ基因；PCR；鉴别

中图分类号 S879.2；TS251.5 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）34-202-02

近年来，动物源性食品掺杂掺假等各种食品安全事件频发。在西方，一项对近千种肉制品的检测分析表明，有近20%的产品存在标识与品种不完全相符的现象[1]。研究动物源性食品安全检测技术，对食品动物源性成分进行鉴定，显得尤为重要。

PCR技术由于其操作简便、快速高效等特点，已在国内外肉类掺假研究中得到广泛应用，并取得创新性成果[2-4]，目前已成为肉制品品种鉴别最常用的方法之一。动物线粒体基因组DNA序列具有高度的物种特异性，是设计肉类成分定性检测的首选靶点，包括细胞色素b（Cyt b）基因、12S rRNA、16S rRNA、DLoop基因等[5-7]。

笔者选择16S rRNA基因和COⅠ基因序列为目标基因，通过基因序列比对，设计筛选出鸭特异性引物，以羊肉、牛肉、猪肉、兔肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉9种动物DNA为模板，建立运用PCR技术鉴别畜禽肉中鸭源性成分快速鉴别方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料 以市售合格的牛、羊、猪、兔、鸽、鹌鹑、鸡、鸭及鹅肉为试验素材，各物种肉样充分搅碎混匀，-20 ℃保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取。

采用离心柱式组织基因组DNA小量抽提试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取DNA。提取的总DNA样品溶于100 μl洗脱液TE中，于-20 ℃保存备用。

1.2.2 引物设计与合成。

根据GenBank公布的鸭线粒体DNA（登录号为KJ833587）16S rRNA基因和COⅠ基因序列，利用Primer Premier5.0软件设计筛选特异性引物对，并送至上海生工生物工程有限公司合成。取适量引物用高压灭菌后的超纯水溶解，配制成10 μmol/L的储备液。引物序列、Tm值与扩增片段大小见表1。

1.2.3 PCR扩增。20 μl PCR扩增体系：2×Tag Master Mix （南京博尔迪公司）10 μl，10 μmol/L引物各0.3 μl，模板1 μl，ddH2O 8.4 μl。

反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸60 s，共28个循环；最后72 ℃延伸4 min。

1.2.4 PCR产物检测和测序 。

PCR反应完毕后将产物取出，利用1.5%琼脂糖（Promega公司）凝胶电泳检测，并割胶回收纯化，交由上海华大公司进行测序，所有序列采用双向测序，以便比对核实，测序结果与GenBank上已知序列进行比对。

1.2.5 灵敏度试验。

将鸭肉DNA模板按梯度进行稀释，分别稀释10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍，观察该方法灵敏度。

2 结果与分析

2.1 线粒体DNA 16S rRNA和COI基因PCR特异性检测

将PCR产物测序结果与GenBank 上已知序列进行比对，结果显示，鸭的测序结果与已发表序列（GenBank登录号分别为KJ833587.1、KJ833586.1）的同源性均在99%以上，与预期基本一致，确定为鸭肉成分。

以羊肉、牛肉、猪肉、兔肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉9种动物肌肉DNA为模板，分别对所设计筛选的鸭引物进行特异性研究。根据鸭线粒体16S rRNA设计的引物，只有鸭的DNA模板能扩增出222 bp的目的条带（图1）；利用鸭线粒体COⅠ基因设计的引物，只有鸭的DNA模板能扩增出96 bp的目的条带（图2）。

3 讨论

肉与肉制品掺杂、掺假是目前食品质量控制面临的重要挑战。一些不法商家或个人为了追求自身利益以低价劣质的肉冒充高价优质的肉，严重侵犯了消费者合法权益。对食品中原料肉进行掺假、掺杂检验势在必行，其重点是快速、准确地鉴定肉品成分来源。

近年来，PCR技术已逐步成为肉类种属鉴定的核心方法[8-9]。何玮玲等[10]基于动物线粒体细胞色素b基因的差异性位点，建立并优化多重PCR反应体系，实现4种肉类（猪肉、牛肉、羊肉和鸡肉）的快速鉴别。Soares等[11]应用双重PCR在猪肉中成功检测到禽肉。Ghovvati等[12]基于线粒体12S rRNA和16S rRNA基因应用多重PCR技术对反刍动物、家禽和猪进行鉴别。陈冬等[2] 基于牛线粒体12S rRNA基因，设计通用引物，成功用于混合鲜牛肉及制品中牛种来源鉴别。

该研究主要根据鸭线粒体基因组编码基因16S rRNA基因和COⅠ基因序列的位点差异设计特异性引物，进行PCR扩增检测，对包括羊、牛、猪、鸡、兔、鸽、鹌鹑、鸭、鹅9种动物在内的畜禽肉进行动物源性鉴别，经过多次重复试验证明，所选定的鸭引物对只有在鸭DNA模板存在的情况下才会发生PCR扩增，检测灵敏度较高，16S rRNA基因灵敏度达1.98×10-2ng/ul，COⅠ基因灵敏度达1.98×10-1ng/ul，建立了快速、准确的畜禽肉中鸭源性成分PCR鉴别方法。在下一步工作中，将开展16S rRNA和COⅠ基因序列荧光定量PCR技术，进一步研发食品中动物源性成分分析方法，为保障肉类产业健康发展、维护市场秩序提供有效保障。

参考文献

[1]

BALLIN N Z， VOGENSEN F K， KARLSSON A H.Species determinationcan we detect and quantify meat adulteration？[J]. Meat science， 2009， 83（2）： 165-174.

[2] 陈冬，柏凡，周明亮，等.基于线粒体12S rRNA基因鉴别混合牛肉及制品的牛种来源[J].遗传，2008，30（8）：1008-1014.

[3] YIN R H， BAI W L， WANG J M， et al. Development of an assay for rapid identification of meat from yak and cattle using polymerase chain reaction technique[J]. Meat science， 2009， 83（1）： 38-44.