热带海洋红藻中总酚类化合物含量研究

安婷婷 李玲娜 王鹤

摘要 [目的]开发一种筛选高酚类化合物含量的海洋红藻方法。[方法]对FolinDenis法测定的红藻中总酚类化合物含量进行了研究，通过Na2CO3溶液和FolinDenis试剂用量以及显色时间等因素的研究，得出最佳反应体系，同时验证最佳检测条件。[结果]最优试验方法为1.0 ml的样品提取液中依次加入20 ml水、3.0 ml饱和Na2CO3溶液、5.0 ml FolinDenis试剂，摇匀，显色70 min，在713 nm波长处测定吸光度；红藻的总酚类含量在0.04～0.80 mg/ml范围内吸光度和总酚类含量具有良好的线性关系，符合回归方程y=1.470 5x-0.003 8（R2=0.999），平均加标回收率为99.93%，RSD为0.62%。[结论]FolinDenis法经济、省时、简单、快捷，可用于大量筛选高酚类含量的海洋红藻。

关键词 酚类化合物；筛选方法；红藻

中图分类号 S986.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）34-148-02

海藻溴酚化合物为海洋生物特有的卤代化合物，因其大多具有新颖的化学结构及独特的生物活性，为获得全新结构的新药提供了宝贵的化合物来源，近年来逐步引起了海洋药物研究者的注意。该类化合物在抗炎[1]、抗菌、抗氧化、抗肿瘤[2-3]、α葡萄糖苷酶抑制、蛋白酪氨酸磷脂抑制[4]等方面表现出独特的生物活性。目前，国内外学者已将海藻溴酚化合物作为治疗糖尿病、动脉粥样硬化、恶性肿瘤等重大疾病的药物，并已获得了发明专利或新药批件[5-6]。

常用的体外降血糖模型α葡萄糖苷酶法所需要的对硝基苯αD葡萄糖吡喃苷、α葡萄糖苷酶价格昂贵且保存方法特殊，并不适用于筛选大量的海洋红藻资源。该研究对FolinDenis法测定的红藻中总酚类化合物含量进行了研究，通过Na2CO3溶液和FolinDenis试剂用量以及显色时间等因素的研究，得出最佳反应体系，同时验证最佳检测条件，旨在建立红藻中总酚类化合物含量的筛选方法，为后期筛选高酚类含量的红藻奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器

紫外分光光度计 （UV2401PC）；轨道式振荡仪（OS100）；超声微波清洗仪（SK450HP）；台式高速冷冻离心机（TGL16MC）。

1.2 试剂与药材

麒麟菜（琼海），于2011～2013年期间采集，由海南省药物研究所李玲娜主任鉴定；所用试剂均为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 溴酚化合物的提取。

称取麒麟菜粉末10 g于250 ml锥形瓶中，加入100 ml 50%的乙醇，超声30 min，提取2次，将提取液抽滤，滤液转移至500 ml圆底烧瓶中，减压浓缩至干，向烧瓶中加入25 ml纯化水，超声30 min溶解，转移至50 ml棕色容量瓶中，定容，备用。

1.3.2 FolinDenis分光光度法测定麒麟菜中酚类物质含量最佳试验条件的摸索。

1.3.2.1 对照品的选择。称取间苯三酚1.229 55 g于250 ml容量瓶中，加入纯化水溶解，加入0.5 ml F.D试剂，于轨道式振荡仪上130 rpm振摇30 min，加入1.0 ml饱和Na2CO3溶液，用纯化水定容，避光显色80 min，在800～400 nm波长处进行图谱扫描，麒麟菜样品扫描方法同对照品。

1.3.2.2 饱和碳酸钠溶液的用量。取数支50 ml容量瓶，各加入20 ml纯化水、1.0 ml 0.2 mg/ml间苯三酚溶液、2.0 ml F.D试剂，摇匀，静置6 min，分别加入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml饱和Na2CO3溶液，用纯化水定容，摇匀，静置避光显色80 min，以空白试剂为参比，于713 nm波长处测定吸光度。

1.3.2.3 FolinDenis试剂的用量。取数支50 ml容量瓶，分别加入20 ml纯化水、1.0 ml 0.2 mg/ml间苯三酚标准液，容量瓶中依次加入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml F.D试剂，摇匀，静置6 min，分别加入3.0 ml饱和Na2CO3溶液，用纯化水定容，摇匀，静置避光显色80 min，以空白试剂为参比，于713 nm波长处测定吸光度。

1.3.2.4 最佳显色时间。取数支50 ml容量瓶，各加入20 ml纯化水、1.0 ml 0.2 mg/ml间苯三酚标准液、5.0 ml F.D试剂，摇匀，静置6 min，分别加入3.0 ml饱和Na2CO3溶液，用纯化水定容，摇匀，静置避光顯色5、15、20、30、40、60、80、90、100、120 min，于713 nm波长处测定吸光度。

1.3.2.5 标准曲线的绘制。取数支50 ml容量瓶，分别加入20 ml纯化水，再分别加入0、0.04、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.8 mg/ml的间苯三酚标准液1.0 ml，按最佳试验条件，于713 nm波长处测定吸光度。

1.3.2.6 精密度试验。取数支50 ml容量瓶，分别加入20 ml纯化水，再加入0.2 mg/ml间苯三酚标准液1.0 ml，按最佳试验条件，于713 nm波长处测定吸光度，做6份平行试验，计算RSD。

1.3.2.7 样品中酚类化合物的测定。取数支50 ml容量瓶，分别加入20 ml纯化水，再分别加入1 ml麒麟菜样品3份，按最佳试验条件，于713 nm波长处测定吸光度。

1.3.2.8 回收率试验。取数支50 ml容量瓶，分别加入1 ml麒麟菜样品，再依次加入0.25、0.50 mg各3份，摇匀，按最佳试验条件，于713 nm波长处测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 图谱扫描

因间苯三酚与酚类化合物均具有苯环的相似结构，筛选模型选用间苯三酚作为对照品，样品光谱扫描图谱与间苯三酚基本相同（图1），且均在波长为713 nm处有最大吸收峰，故此模型选择713 nm为检测波长。

2.2 饱和碳酸钠溶液的用量和FolinDenis试剂的用量结果

通过对比不同体积的饱和碳酸钠结果（图2）发现，吸光度随着饱和碳酸钠用量的增大而增大，当饱和碳酸钠的体积为3.0 ml时吸光度达最大值，显色最完全，而后，吸光度反而随着饱和碳酸钠体积的增大而减小，故此模型选择饱和碳酸钠的用量为3.0 ml。同样，通过FolinDenis试剂用量曲线结果（图2）可知，FolinDenis试剂用量在5.0 ml时反应体系颜色较为清亮，反应体系最为稳定，对吸光度的影响比较小；当FolinDenis试剂用量超过5.0 ml时，随用量的增加而出现白色沉淀，且吸光值不稳定，因此此模型选用5.0 ml的FolinDenis试剂。

2.3 最佳显色时间结果

由图3可知，吸光度在60～120 min范围内趋向于稳定，变化范围小于1%，所以此模型选择70 min 为显色时间。

2.4 标准曲线和回归方程

由图4可知，间苯三酚的线性方程为y=1.470 5x-0.003 8（R2=0.999），线性范围为0.04～0.80 mg/ml。

2.5 精密度试验 按“1.3.2.6”操作，6份平行试验的RSD为0.25%，表明此方法的精密度较高。

2.6 样品中酚类化合物的测定 按“1.3.2.7”操作，3次样品平行测定的吸光值分别为0.373、0.370、0.376，麒麟菜中总酚类化合物的含量为1.28 mg/g，RSD为0.70%。

2.7 回收率

由表1可知，加标回收率为99.12%～100.74%，平均加标回收率为99.93%，平均RSD为0.62%。