耐低温灰树花工厂化生产菌株的筛选

冯芳侠 付庆伟 王凤春 付庆成

摘要[目的]筛选适合低温环境生产出菇的菌种。[方法]通过比较13个野生灰树花菌株的菌丝生长速率、生长势、拮抗性，并以栽培周期、子实体品质及前期生物学转化率等为指标进行工厂化栽培考察。[结果]菌株“ZDL05”在（18±2）℃时68 d完成2次出菇，且生物转化率为82.3%，同时在颜色、风味、叶片厚度、口感及朵形等方面表现优秀，适合灰树花低温工厂化栽培。[结论] 灰树花菌株ZDLM05可以作为秋冬季或较低温地区工厂化生产菌种。

关键词灰树花；耐低温；菌株筛选；工厂化

中图分类号S646文献标识码A文章编号0517-6611（2015）34-056-03

灰树花[Grifola frrondosa（Dicks.Fr.）S.F.Gray]是担子菌亚门层菌纲无隔担子菌亚纲非褶菌目多孔菌科灰树花属真菌，为珍贵的药食两用菌。其人工栽培历史较短，受前期生物转化率低、多糖含量低等因素制约，灰树花栽培成本较高，工厂化生产技术发展缓慢，制约了整个行业的发展。筛选前期生物转化率高、适合低温环境出菇的工厂化栽培菌种，既能满足秋、冬及初春较低温度环境下工厂化出菇，又能降低生產成本，可以极大地满足灰树花工厂化栽培的需求[1]。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1培养基配方。

基础培养基：马铃薯200.00 g，栗木屑50.00 g，麦麸50.00 g，葡萄糖20.00 g，蛋白胨2.00 g，维生素B1 0.01 g，CaH2PO4 3.00 g，MgSO4 1.50 g，琼脂粉20.00 g，定容至1 000 ml。

原种、栽培种培养基：栗木屑35%、棉籽皮15%、麸皮15%、玉米芯20%、栗蓬10%、海泡石粉2%、蔗糖1%、过磷酸钙1%、石膏1%，含水量65%，常压100 ℃灭菌12 h。

1.1.2菌株及来源。

13个灰树花菌株系从唐山市迁西县东荒峪、汉儿庄等地收集、分离纯化和筛选获得的野生菌株。

采用组织分离法，取子实体柄叶结合部位组织接种到基础培养基平板上，在25℃下恒温培养形成菌落，采用菌丝尖端纯化法纯化菌种，并用基础培养基斜面保存备用，依次编号为ZDLM01～ZDLM13。以当地主栽品种“小黑汀”为对照，由河北省燕山科学试验站提供。

1.1.3试剂。

木聚糖，Sigma公司；其他试剂如醋酸钠、酒石酸钾钠、丙酮、3，5二硝基水杨酸（DNS）、MgSO4、NaOH等均为国产分析纯试剂。

DNS显色剂（3，5二硝基水杨酸显色剂）：称取10 g 3，5二硝基水杨酸溶于蒸馏水中，加入20 g氢氧化钠、200 g酒石酸钾钠和500 ml水，加热溶解后再加入重蒸酚2 g、无水亚硫酸钠0.5 g，待全部溶解后，冷却，蒸馏水定容至1 000 ml，贮于棕色瓶中，放置7 d后使用，用前过滤。

醋酸钠缓冲液（0.1 mol/L，pH 4.6）：称取NaAC 0.8 g，加入蒸馏水80 ml溶解，用醋酸调pH至4.6，最后用蒸馏水定容至100 ml。

木聚糖溶液（1%）：称取木聚糖0.501 g，用蒸馏水溶解并定容至50 ml。

浓缩胶缓冲液（0.5 mol/L，pH 6.8）：称取6.06 g Tris，加80 ml dd H2O溶解，用盐酸调pH至6.8，最后定容至100 ml。

1.1.4主要仪器。

UV8100紫外可见分光光度计，北京莱伯泰科仪器股份有限公司；

洁净工作台，上海博迅实业有限公司；

梅特勒电子分析天平，河南郑州南北仪器设备有限公司；

LDZH150KBS型立式蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂。

1.2试验方法

1.2.1最适发菌温度试验。

采用生长速率法进行测定。用基础培养基做成平板，接种环挑菌种置于平板中央，分别在16、18、20、22、24、26、28、30 ℃下恒温培养10 d后，测量菌落直径，每个处理3个平行试验，结果取平均值。

1.2.2出菇试验。

以栗木屑35%、棉籽皮15%、玉米芯20%、麸皮15%、栗蓬10%、海泡石粉2%、蔗糖1%、过磷酸钙1%、石膏1%为配方。将栗木屑、棉籽壳、栗蓬渣等主料称好，混在一起搅拌均匀，再将麸皮、过磷酸钙、蔗糖、石膏等辅料随水拌入料中，料水比为1∶1.2～1∶1.3，含水量65%，常压100℃灭菌12 h。

以主栽品种“小黑汀”为对照，与13个野生优种各200棒作对比试验；按照“1.2.1”结果中各菌种最适生长温度（±2 ℃）为培养温度，采用层架式发菌，菌丝长满菌袋后，剥袋置于长×宽×深=2.0 m×0.5 m×0.3 m生长畦内，覆土栽培，出菇两潮为止。分别记录2次出菇量、出菇温度、出菇时间、平均单重，以前期生物转化率、产量、颜色、气味、叶片厚度、产量等指标[2-3]，筛选低温环境下前期生物转化率、商品性状较好的野生优种。

1.2.3菌丝生长势测定。

以主栽品种“小黑汀”为对照，将3个野生优种在基础培养基活化后，沿菌落的边缘取直径5 mm的菌块，分别接种于PDA加富平板培养基上。每个菌种3个重复，于各自适宜的生长温度下恒温培养3 d，每天定时观察菌落的生长状况，并精确测量菌落半径，计算菌丝生长速度。

菌丝生长速度（mm/d）=菌落半径（mm）/菌丝生长天数（d）

1.2.4木聚糖酶活力测定。

沿菌落边缘挖取模拟出菇培养基上的菌丝各1 g于试管中，加pH 4.6 0.1 mol/L醋酸钠缓冲液10 ml，25 ℃浸提过夜（12 h），将浸提液用滤纸过滤，取滤液1 ml加入试管中，然后加入9 ml蒸馏水稀释，充分混匀，得粗酶液待用。

将pH 4.6醋酸钠缓冲溶液、1%木聚糖溶液及粗酶液于40 ℃水浴预热2 min，然后在试管中依次加入pH 4.6醋酸钠缓冲溶液1 ml，1%木聚糖溶液0.5 ml，稀释后的粗酶液0.5 ml。40 ℃水浴30 min后，加入DNS 3 ml，100 ℃水浴5 min后水冷，在波长510 nm下测定OD值。酶活力以样品与底物反应30 min后吸光值的改变表示。

1.2.5拮抗性试验。

将活化后的供试菌株沿菌落边缘用打孔器切下直径5 mm的菌块，每2个不同菌株的菌块相距约1 cm，接种于同一基础培养基平板上，于20 ℃恒温培养箱内培养7 d，观察不同菌株间是否有拮抗线的存在，拮抗线是否明显。

2结果与分析

2.1最适发菌温度

一般灰树花菌株菌丝体生长适宜温度为22～30 ℃，在22 ℃以下或30 ℃ 以上生长缓慢。由表1可知，ZDLM03菌株菌落直径在28 ℃时最大达到4.9 cm。其中，ZDLM05、ZDLM06、ZDLM12在相对低温下（18～24 ℃）具有较大的生长量；ZDLM05在此温度范围下菌落直径能达到4.4 mm，有较大的应用空间。

2.2出菇试验结果

由表2可知，传统优种“小黑汀”比ZDLM05号优种2次出菇时间长15 d，且后者在较低温度（18±2）℃下生物转化率达到82.3%；ZDLM12优种也比“小黑汀”早7 d完成出菇，生物转化率同比高6.3%。

结合灰树花子实体的特有香味、灰黑色、叶片厚实等传统评价指标，优种ZDLM05具有耐低温（18±2） ℃、前期生物转化率高（82.3%）及较好的产品特性，符合工厂化生产菌种的特征。

2.3菌丝生长势

由表3可知，4个灰树花菌株在PDA加富培养基上的生长速度虽存在一定差异，但不明显，生长速度排列为ZDLM05>ZDLM12>ZDLM06>小黑汀；ZDLM06灰树花优种生长势较旺，有粗壮优势菌丝发育。

2.4木聚糖酶活力

"小黑汀"、ZDLM05、ZDLM06、ZDLM12灰树花菌株的木聚糖酶活力分别为13.12±0.11、25.25±0.29、24.67±0.14、19.52±0.06 U，3个筛选的灰树花菌种均高于对照组；其中ZDLM05菌株的活力最高，接近“小黑汀”的2倍；此结果与菌种的生物转化率相一致。

2.5 拮抗性

由表4可知，“小黑汀”和3个筛选的灰树花菌株间拮抗作用明显，表明考察的3个野生菌种相对独立，亲缘关系较远。

3结论与讨论

我国工厂化灰树花生产分为液体发酵罐菌丝体发酵生产灰树花多糖和工厂化栽培生产子实体两类。第一类主要满足工业及医药生产需求，已经发展相对成熟；第二类主要满足日益增长的营养食材的需求，产品产量低、成本高，产业发展缓慢，其中前期生物转化率低、生长周期长是最重要的制约因素。工厂化栽培食用菌通常只采收第一潮菇，以提高菇房利用率，降低生产成本。前期研究表明，灰树花第二潮出菇量为第一潮出菇量的50%～85%，出菇周期短的灰树花品种，收两潮菇可以降低成本40%～78%。

因此，以前期生物转化率为指标，筛选生产周期短、耐低温的灰树花菌种，不仅可以提高单位产量和菇房使用率，还可以降低冬季生产的操作成本和生产风险，实现工厂化生产的利润最大化。该试验通过最适生长温度和小试工厂化生产，只能提供灰树花优种的筛选依据，不能完全依靠其结果作为菌株筛选的最终标准。该试验阶段获得ZDLM05、ZDLM06和ZDLM12共3个野生优种，均能在小于或等于22 ℃时正常出菇；其中ZDLM05可以在（18±2）℃时68 d完成2次出菇，且生物转化率达到82.3%；同时子实体性状和产品标准较高，是难得的工厂化生产菌种。该研究继续考察了3个野生优种的生长势、木聚糖酶活力和拮抗性，以定性或半定量的形式考察了菌种的亲缘关系和生物转化能力，其中ZDLM05不是每项指标均最佳，但综合评比适宜工厂化栽培。

綜上所述，灰树花菌株ZDLM05可以作为秋冬季或较低温地区工厂化生产菌种，能在68 d内完成2次出菇，且生物转化率达到82.3%，与传统主栽品种“小黑汀”相比，优势非常明显；同时菌株生物稳定性好，可进一步研究其栽培工艺、环境控制参数等条件，保证高产、稳产。

参考文献

[1] 潘辉，王瑞娟，李正鹏，等.工厂化栽培灰树花菌株的筛选研究[J].北方园艺，2011（1）：188-191.

[2] 沈高潮，姚庭永，姚松涛，等.灰树花“小黑汀”的特性及栽培要点[J].食药用菌，2014，22（1）：59-60.

[3] 陈秀娟.灰树花工厂化周年栽培技术[J].中国园艺文摘，2012（6）：141-142.