流式细胞学检测三阴性乳腺癌的生物学意义

张景臣1（通讯作者） 刘 薇1 毛大华2

【摘 要】目的：S期细胞比率（S-Phase Fraction SPF）、倍体表达在三阴性乳腺癌与非三阴性乳腺癌之间有无差别；方法：通过流式细胞仪检测135例乳腺SPF及倍体表达情况。结果：19例三阴性乳腺癌中SPF：9.32±4.89；116例非三阴性乳腺癌SPF：5.65±4.14；三阴性乳腺癌中二倍体6例、异倍体13例，非三阴性乳腺癌二倍体49例、异倍体67例；结论：三阴性乳腺癌的SPF值较非三阴性乳腺癌差异明显有统计学意义，而倍体表达无明显差异无统计学差异；高表达的SPF与年龄、临床分期有明显相关性，而与淋巴结有无转移、肿块大小无明显相关性。

【关键词】三阴性乳腺癌；流式细胞学检测；S期细胞比率 倍体表达

三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體（ER）、孕激素受体（PR）及人表皮生长因子受体2（HER-2）均为阴性的乳腺癌亚群。TNBC为预后最差的乳腺癌亚型，具有侵袭性强，恶性程度高、预后差等特点[1]，除化疗外尚无有效地全身治疗措施，依靠现有的临床和病理指标难以对三阴性乳腺癌患者进行最优化的个体化治疗和预后分析。

受体检测和阳性判定标准 ER、PR受体采用免疫组织化学法检测，阳性细胞比例≥1%判定为阳性。HER-2受体采用免疫组化与免疫荧光原位杂交（FISH）相结合的方法进行检测，阳性判定标准为：①免疫组织化学检测“+++”定义为阳性，“—”和“+”定义为阴性。②免疫组织化学检测“++”必须经FISH检测再次确定：若FISH（fluorescence in situ hybridization，FISH）为阳性则定义为HER-2受体阳性，若FISH为阴性则定义HER-2受体阴性。③免疫组织化学检测为“+++”或FISH检测阳性，两者之一阳性即可定义HER-2受体阳性。

流式细胞检查（flow cytometry，FCM）是20世纪70年代发展起来的对单细胞定量分析的一种新技术，它采用计算机、激光和荧光标记单克隆抗体技术，能在短期内对大量标本进行检测，具有极高的检测速度与统计精确性。而且从单一细胞可以同时测得多个参数，为生物医学与临床检验提供了一个全新视角和强有力的手段。经FCM检测后一般能获得三项参数：DNA倍体数（ploidy）、DNA指数（DNA Index DI）和细胞群体中进行DNA合成的增殖细胞的百分比（S-phase fraction，SPF）。DNA倍体是细胞核中重要遗传物质DNA含量的一个客观指标，肿瘤细胞的无限制分裂、增殖与细胞核中DNA含量变化密切相关。DNA倍体是组织细胞的基本生物学特性之一。肿瘤细胞DNA倍体变化不仅对肿瘤发生发展有重要理论意义，而且对肿瘤的诊断、鉴别诊断、肿瘤转移、肿瘤治疗和预后判断也有一定的临床意义[2]。S期指数是一项检测DNA合成的增殖细胞百分比的指标，能较准确地计算处于增殖期的细胞比例，而肿瘤增殖强弱能体现其侵袭性。

1.研究对象：回顾性分析2010年1月～2013年1月郑州人民医院乳腺外科收治的乳腺癌病例，组织来源新鲜乳腺癌癌组织，在临床工作中快速冰冻病理确诊的乳腺癌，留取的癌灶组织；入选的乳腺癌病例，均为女性，全组135例乳腺癌，LumunalA型占52.6%（71/135），Luminal B型占24.4%（33/135），HER-2过表达型占8.9%（12/135），三阴性型占14.1%（19/135），大于等于50岁有52例，小于50岁有83例，平均年龄47.6岁，中位年龄48岁；按1997年UICC TNM分期，III期21例，II期94例，I期20例；肿瘤≤2cm 21例，2cm< ≤5cm 92例，>5cm 22例，淋巴结转移66例，无淋巴结转移69例。

2.研究方法

2.1 主要试剂

美国BD公司Ccycle TESTTMPLVS DNA Rent Kit试剂盒，磷酸缓冲液（PBS），A液（trysin buffer），B液（trysin inhibitor and RNase buffer），C液（propidium iodide stain solution）。

2.2 检测方法

2.2.1 单细胞悬液样品的制备

将新鲜病灶组织50-100mg剪碎或蜡块组织去蜡后剪碎，同时用PH值为7.4的磷酸缓冲液（PBS）缓滴，用300目滤膜过滤，得到的单细胞倒入试管内离心（1000转/分，5分钟）；弃去上清液后，待检。

2.2.2 DNA含量及倍体检测的样品制备

应用BD公司Ccycle TESTTMPLVS DNA Rent Kit试剂盒，PI染色法制备样本；①在每个细胞悬液试管中加入250μl A液（trysin buffer），手轻叩试管（流式细胞术专用试管）使充分混合，放置10分钟；②在每个加入A液试管中再加入200μl B液（trysin inhibitor and RNase buffer），手轻叩试管使充分混合，放置10分钟；③在每个已经加入A、B液试管中再加入200μl 冷的（2℃～8℃）C液（propidium iodide stain solution）手轻叩试管使充分混合，在2℃～8℃冰箱内避光放置30分钟，即可上机检测。

2.2.3 主要仪器及校正

流式细胞检测采用美国BD公司流式细胞仪FACSCalibur，激发光源为2W氩离子激光器，输出功率300W，激发波长488nm，分别进行单参数检测。上机前先以标准微球调整仪器，使CV<2%，DNA含量检测前先做BD公司DNA质控下载质控条件检测样品DNA。DNA含量检测以线性方式采集数据。DNA数据采用机载软件分析。

3.研究结果：

表1：基线期三阴性与非三阴性临床病理参数比较：

临床病理参数 三阴性 非三阴性 x2 P值

年龄 0..26 0.871

<50岁 12 71

≥50岁 7 45

月经状况 0.356 0.551

绝经前 15 84

绝经后 4 32

淋巴结转移 0.407 0.523

有 8 58

无 11 58

临床分期 2.053 0.358

I期 2 18

II期 12 82

III期 5 16

肿块大小 0.667 0.717

≤2cm 2 19

2cm< ≤5cm 13 79

>5cm 4 18

三阴性与非三阴性乳腺癌病理参数之间无统计学差异；

表2：三阴性与非三阴性流式细胞学检测结果：

三阴性 非三阴性 P值

S期细胞比率 9.32±4.89 5.65±4.14 0.01

二倍体 6 49 0.38

异倍体 13 67

SPF表达中三阴性明显高于非三阴性，而倍体表达无统计学差异；

再对135例乳腺癌按年龄、淋巴结有无转移、肿块大小、临床分期进行单因素分析SPF、进行统计学比较。

表3：单因素分析SPF与临床病理参数

临床病理参数 SPF平均值±标准差 P值

年龄 0.038

<50岁 5.52±3.67

≥50岁 7.12±5.25

淋巴结转移 0.445

有 6.38±3.99

无 5.81±4.72

临床分期 0.00

I期 5.09±4.87

II期 6.18±4.48

III期 6.83±3.83

肿块大小 0.546

≤2cm 5.62±4.54

2cm< ≤5cm 6.29±4.62

>5cm 6.62±3.96

4.讨论：

SPF高者细胞增生活跃，预后较差[3]。Charlotte R wenger等[4]总结了273篇有关乳腺癌SPF研究文献指出，SPF与其他乳腺癌的预后指标有明显的相关性，。SPF较高患者生存率较短。SPF可以反映乳腺癌的增殖活性和侵袭能力。另外，ER阳性者SPF较低而ER阴性者SPF较高是因为乳腺致癌后可失去合成ER的能力，ER表达有赖于细胞分化，与增殖呈负相关，这也比较合理地解释了ER阳性患者乳腺癌患者预后较好的原因。高SPF与年龄因素有关，本研究中大于等于50岁SPF：7.12±5.25与小于50岁SPF：5.52±3.67比较有统计学意义，这与yuan ZY，Wang SS，等TNBC占全部乳腺癌的10%～20%，多见于绝经前的女性[5].的研究结果不同，本研究中SPF与临床分期有关，临床分期越高，SPF值较大但与肿块大小无明显相关性这与Brvan BB，Schnitt SJ等研究提示：TNBC与其他类型乳腺癌相比，预后差，生存时间短，肿块较大[6，7]；研究结论之间的差异可能与本研究标本数量较少有关；Rakha EA，EL Sayed ME研究结果提示：高SPF腋窝淋巴结转移率低[8]，与本研究SPF与淋巴结有无转移无明显相关性略有不同。与non-TNBC易出现淋巴结转移不同，TNBC更易出现肝脏、肺部等内脏器官转移[9]；TNBC患者不易出现腋窝淋巴结转移，而易出现远端器官肝脏、肺脏转移，出现跳跃转移征象；高SPF化疗敏感性较高[10]但预后较差，出现这种矛盾的现象可能TNBC这一亚型可能有其特殊的生物学行为，有待进一步研究。

参考文献：

[1]Crown J，O，Shaughnessy J，Gullo G，Emerging targeted therapies in triple-negative breast cancer[J].Ann Oncol，2012，23（6）：56-65..

[2]Martinez Jabaloyas JM，Jimeneez Sanchez Sanchex A，Ruiz Certla JL，etal.Prognostic Value DNA ploicly and nuclear morphometry in metaslatic prostale cancer[J].Actes Urol Esp，2004，28（4）：298-307.

[3]陈娟，张锦等.DNA含量及S期细胞比值与肺癌生物学特性的关系[J].西安交通大学学报，2006，27（3）：261-263.

[4]Charlortte R.S-phase fraction and breast cancer a decade of experience.Breast Cancer Reseach and Treatment，1998，51：255.

[5]yuan ZY，Wang SS，Gao Y，et al.Clinical charateristics and prognosis of triple-negative breast cancer：a reportor of 305cases[J]Ai Zheng，2008，27（6）：56-565.

[6]Brvan BB，Schnitt SJ，Collins LC.Ductal carcinoma in situ with basallike phenotype：a possible precusor to invasive bassal-like breast cancer[J].Mod Pathol，2006，19（5）：617-621；

[7]Gerson R，Alban F，Villalobos A，et Recurrence and survival rates among early breast cancer cases with triple negative immunophenotype[J].Gac Med，Mex，2008144（1）：27-34.

[8]Rakha EA，EL Sayed ME，Green AR，et al.Prognostic markers in triple-negative breast cancer[J].Cancer，2007，109（1）：25-32.；

[9]Rakha EA，EL Sayed ME，Green AR，et al.Prognostic markers in triple-negative breast cancer[J].Cancer，2007，109（1）：25-32.；

[10]張景臣，毛大华.S期细胞比率对乳腺癌新辅助化疗敏感性的预测价值[J/CD].中华乳腺病杂志：电子版，2013，7（4）259-262.；

作者单位：1.郑州人民医院 乳腺科（张景臣 刘薇）2.贵阳医学院第一附属医院（毛大华）

通信作者：河南 郑州 450000 张景臣，