组织干细胞的培养及定向分化实验

邵志华， 许 洁， 沙继宏， 吕立夏， 徐 磊，李 姣， 贾 松， 李思光

(同济大学a.医学院干细胞研究中心;b.医学与生命科学实验教学中心，上海 200092)

0 引言

科学思维能力和解决问题的能力是全球医学教育的基本要求之一，也是我国进行素质教育与卓越医师培养的目标之一[1-3]。而实验教学能促进学生发现问题、解决问题素质的形成，引导他们养成科学思维和团结协作精神，因此是培养学生创新能力和实践能力的有效途径[4-5]。随着实验教学改革的推进，高校的实验教学已经突破了传统单一的实验模式，建立了综合型、设计型和开放型等多种形式的实验，充分发挥了实验教学培养学生创新能力和实践能力的作用[6-7]。细胞培养作为医学研究中普遍应用的基本技术，目前已经被广泛应用于医学本科及研究生的实验教学，其在一定程度上促进了学生综合素质的培养[8-10]。然而，目前的细胞实验教学还有许多不足之处。如在实验方法方面，往往为孤立的实验或多个实验拼合而成，割裂了一般科学实验的过程。在实验内容方面，常常注重经典，缺乏经典与前沿的结合;注重基础，缺乏基础与临床实践的结合;注重传承，缺乏科研成果的转化教学。

干细胞(Stem Cells，SC)是一类具有自我更新及分化潜能的细胞，在疾病的细胞治疗和器官移植方面有着巨大的医学应用潜力，是世界医学界研究的热点[11-12]。因其重大的理论意义和无可估计的实际价值，高校特别是医学院校应积极开展干细胞教学[13]。随着干细胞研究热潮的兴起[14]，同济大学成立了干细胞研究中心和临床转化中心，取得了一些研究成果，特别是在干细胞的培养及分化方面积累了一些经验。

针对目前细胞实验教学中存在的问题，结合本校的办学定位和专业特色，我们设计并开展了“组织干细胞的培养及定向分化”的实验教学，并在医学院5年制和7年制本科生开展。该实验为一个完整的科学实验，能使学生亲历科学实验的全过程，在实验中培养学生的科研思维能力和解决问题的能力，对学生了解科学发展动态，掌握前沿科学知识和实验技能具有重要意义。

1 实验项目的设计与实施

1.1 组织干细胞的选择

根据细胞来源，干细胞分为胚胎干细胞和组织干细胞。虽然胚胎干细胞具有万能性，能分化为几乎所以的组织细胞，但是因其来源于胚胎，具有伦理问题。而组织干细胞存在于成人各种组织和器官，不存在伦理问题。骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Stromal Cells，BMSCs)是一群来源于骨髓的组织干细胞，因其分离方法简便，体外可大量扩增，细胞存活率高，便于自体移植及调控，在特定的诱导条件下可分化为多种细胞，如骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞等优点，在细胞治疗及组织再生及修复等方面具有广阔的应用前景[15]。鉴于此，我们选择骨髓间充质干细胞作为实验对象。

在诱导分化方面，考虑脂肪细胞诱导分化时间短(7～11 d)，分化效率高(80% ～90%)，容易鉴定(油红O染色10 min)等优点[16-17]，所以我们选择BMSCs诱导分化为脂肪细胞并用油红O染色鉴定。

1.2 实验安排及流程

本实验的内容包括原代培养、传代培养、定向分化和脂肪细胞染色鉴定。为了培养学生良好的科学习惯和团队合作精神，实验分组进行(2个同学一组)，每次实验完毕后进行实验记录，包括细胞培养记录和实验结果记录。具体安排如下(见图1):

第1次，分离骨髓间充质干细胞，原代培养，37°C培养48 h。

第2次，观察细胞形态及密度，传代培养，37°C培养4～6 h后，更换诱导分化培养基，37°C继续培养72 h。

第3次，观察细胞形态、密度及生长特点，换液，37°C培养72 h。

第4次，油红O染色鉴定，统计分化效率。

图1 实验安排及实验流程

1.3 实验考核体系

实验考核是教学过程中的一个重要环节，为了取得良好的效果，对实验过程和结果进行综合考核并给出合理的成绩，是有效地提高教学质量的保证。一种“全过程-多方式-立体化”的评价体系，能确切、客观、全面地评定学生的学习能力[18]。因此，我们从以下4个环节全面考核学生，以达到促进实验教学效果的目的。具体考核内容如下:

(1)动手参与程度和团队合作精神。通过有效的团队协作，培养学生沟通和交流的能力。

(2)实验数据记录和结果。规范实验记录，设计细胞培养实验记录表，要求每次观察细胞后进行拍照，并及时对结果进行描述。目的是培养学生科学、严谨的科学态度及数据信息的管理能力。

(3)实验过程中出现的故障处理。要求以学生为主体，教师为指导的原则，通过学生自主学习、自主分析，最终自主解决问题。达到调动学习的积极性和主动性，形成好的学习方法和习惯，培养其发现问题及解决问题的能力。

(4)实验报告完成情况。要求小组撰写实验论文，分析实验结果，以达到培养学生分析和整理数据的能力。

2 实验建设效果

2.1 实验项目安全、稳定、可行

经过尝试和摸索，建立了以细胞培养为主线，组织干细胞培养为特色的综合性实验项目，编写了实验指导，进行了相关的预实验，并在临床医学5/7年制本科生中连续开展了3年，每组均可获得分化的脂肪细胞(见图2)，效率稳定在60% ～80%左右。实验使用的BMSCs来源于生物安全级大鼠，不涉及伦理问题，没有生物安全隐患。实验不涉及强腐蚀、毒性试剂和具潜在危险的仪器。因此，此实验项目安全、稳定、可行。

图2 BMSCs的培养及脂肪细胞的诱导分化

2.2 实验项目为综合型实验

以往的细胞培养实验教学往往为孤立的实验或多个实验的拼合，缺乏系统性、连续性和完整性，不能真实地体现科学实验的过程。为了培养学生的科研能力，适应当代医学生的培养目标，我们设计了此综合实验项目，具有系统性、连续性和完整性。

实验是以细胞培养为中心的综合实验，涉及组织干细胞的分离和原代培养，细胞传代培养，干细胞的分化和组织化学检测4项基本实验技术及分子生物学、生物化学、组织化学等方面的理论知识。采用原代培养—传代培养—定向分化—细胞鉴定4个连续的实验，实验过程与实际的科学研究一致，为一个完整的科学实验过程，具有系统性、连续性和完整性。由于4个实验内容环环相扣，需要学生认真地完成每一个实验，直至获得最终的结果，因此增加了学生的动脑、动手机会，有利于培养学生的科研思维能力及基本实验技能，为学生的科研能力的培养打下较为坚实的基础。

2.3 实验项目体现了经典与前沿的结合

以前的细胞培养实验常常是用传统的细胞系进行的，如Hela或293细胞，未能与科学发展的前沿结合，不利于学生掌握先进的实验知识和技能。

建设的实验项目是进行组织干细胞的培养、分化和鉴定，而干细胞因其重大的理论意义和无可估计的实际价值，目前成为世界科学界研究的热点，因此，本实验项目在最经典的细胞培养实验的基础上，结合前沿理论知识和实验技能，既传承了经典，又跟上时代的发展，与培养新时期高素质和创新人才的需要相一致。对于学生了解科学发展的动态，掌握前沿科学知识和实验技能具有重要意义。

2.4 实验项目体现了科研成果的转化教学

组织干细胞因其具有多分化潜能，在创伤修复、细胞替代治疗、基因治疗等方面具有很好的临床应用价值和广阔的应用前景，是目前世界性课题，也是项目所在的教学团队主要从事研究的课题之一。其中，骨髓来源的间充质干细胞(BMSCs)分化为脂肪细胞的研究取得了较好的研究成果，分化的脂肪细胞成熟度高、重现性好、难易程度适中，适合转化为实验教学项目[19]。实验项目在教学中的顺利实施证明了科研成果的转化可使实验教学内容紧跟学科技术的发展，充分体现了实验教学是实现科研成果向教学内容转化的主要途径[19-20]。

3 结语

细胞培养为具有百年历史的经典细胞生物学实验技术，在医学教育中具有重要的作用。而干细胞具有十分诱人的临床应用前景，是当今世界研究的热点。因此，干细胞的培养、分离、分化和鉴定是当代医学生应该了解和掌握的实验技能。

实验项目在经典的细胞培养基础上，结合前沿理论知识和实验技能，既使学生掌握了基础实验技能，又使学生了解学科发展的方向，使学生跟上时代的发展，体现了实验项目的前沿性与前瞻性，这与培养新时期高素质和创新人才的需要相一致。

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