地枫皮组织培养获得再生植株的研究

李小泉等

摘要：采用组织培养快繁技术培养地枫皮种苗，为人工栽培提供优良地枫皮种苗。以地枫皮的茎段、顶芽作为外植体，用不同的培养基进行诱导培养获得丛生芽，进而生根获得再生植株。结果表明，地枫皮初代诱导较好的培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；培养基MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+0.3 mg/L NAA较有利于丛生芽继代增殖，增殖系数为3.2；培养基1/2MS+1.0 mg/L IAA较适宜诱导地枫皮无菌芽的生根；在适宜的基质上移栽，地枫皮种苗成活率为70%。得出的方法具有不受季节和地点限制、繁殖系数较高等优点，随着研究不断深入，技术不断完善，将为地枫皮种苗繁育提供技术支持。

关键词：地枫皮；组织培养；丛生芽；生根

中图分类号：Q943.1 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0087-03

收稿日期：2015-03-09

基金项目：广西科学研究与技术开发计划（编号：桂科合14125008-2-21）；广西医疗卫生重点科研课题（编号：重2012115、重200908）；广西壮族自治区卫生厅中医药科技专项（编号：GZBZ14-14）；广西自然科学基金重点项目（编号：2011GXNSFD018037）。

作者简介：李小泉（1968—），男，广西全州人，硕士，副研究员，从事植物组织培养研究。E-mail：1941243276@qq.com。

通信作者：李林轩，助理研究员，从事中药资源保护与开发利用研究。E-mail：starry1125@sina.com。地枫（Illicium difengpi K.I.B.et K.I.M.）别称钻地风、追地风、山八角，地枫皮为其干燥树皮，为木兰科八角属珍稀濒危药用植物[1]。地枫皮主要分布于广西靖西、天峨、都安、马山、龙州等县的岩溶石山山顶，为广西的特有中药材[2-3]，其茎皮、根皮具有祛风除湿、行气止痛等功效，常用于治疗风湿痹痛、气滞腹痛、妇人经期腹痛等症状，治疗效果好，药用价值高，为多种中成药的主要原材料[4]。地枫皮生境分布范围狭窄，生长缓慢，且药用部位为茎皮与根皮，因此采收后植株也无法成活。目前地枫皮药用资源来源于野生自然资源，由于地枫皮种子皮较薄，干燥时种子的油脂会变质，过湿时又容易腐烂，极易丧失发芽能力，加上其生长所需的石灰岩土壤稀少，无法为地枫皮种子的萌芽提供适宜的环境，造成地枫皮繁殖能力弱。随着地枫皮药用需求量不断增加，野生自然资源不断减少，在很多地区濒临灭绝或已绝迹，1999年地枫皮被批准为国家Ⅱ级重点保护野生植物[1]。目前对地枫皮的研究主要集中在资源调查[3]、真伪鉴别[5]、分子标记[6]、化学成分[7]、药理作用[8]等方面，在种苗培育方面还未见报道。因此，本研究通过对地枫皮进行组织培养研究，以期为地枫皮人工栽培提供大量优良种苗，对于保护地枫皮野生种质资源和维护生态系统多样性具有重要意义。

1材料与方法

1.1供试材料

采集广西药用植物园大棚内盆栽的地枫皮，剪取健壮无病虫害植株的茎段、顶芽为外植体。

1.2试验方法

1.2.1外植体灭菌及培养条件将地枫皮茎段、顶芽用洗洁精水浸泡10 min，用清水冲洗15 min，滤干水后在超净工作台中用75%乙醇浸泡30 s，用无菌水清洗1次；在0.1%HgCl2溶液中浸泡5～12 min，用无菌水冲洗3次，每次浸洗3 min，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后，接种于诱导培养基中。培养条件为培养温度（25±3） ℃、光照时间12 h/d、光照度1 500～2 000 lx。培养基中含2%蔗糖、5%琼脂，pH值5.8～62。

1.2.2初代诱导培养基筛选初代诱导以MS为基本培养基，添加不同浓度的植物生长调节剂，诱导培养基分别为：0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA（A1处理）、1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA（A2处理）、1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA（A3处理）、2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA（A4处理）。最佳基本培养基的筛选：将诱导得到的无菌芽分别接入上述试验中获得的最佳生长调节剂组合的MS、B5、N68、VW、N6、ER基本培养基中，观察其生长状况。

1.2.3继代增殖培养以初代诱导培养试验为基础，考察植物生长调节剂对地枫皮丛生芽的影响，设计激素种类和浓度组合为：1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+0.1 mg/L NAA（B1处理）、2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+0.3 mg/L NAA（B2处理）、1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA（B3处理）、2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA（B4处理）。

1.2.4生根培养生根培养基：1/2MS+1.0 mg/L NAA（C1处理）、1/2MS+1.0 mg/L IBA（C2处理）、1/2MS+1.0 mg/LIAA（C3处理）。

1.3计算公式

相关计算公式如下：

污染率=污染外植体数/接种数×100%；（1）

死亡数=死亡外植体数/总外植体数×100%；（2）

诱导率=出芽外植体数/总外植体数×100%；（3）

增殖系数=增殖芽数/接种数；（4）

诱导率=出芽数/接种数×100%。 （5）

2结果与分析

2.1灭菌时间筛选

分别设5、8、10、12 min 4个灭菌时间进行试验，外植体接入初代诱导培养基中培养10～15 d，记录污染的外植体数，统计污染率。30 d时分别记录死亡的外植体数，统计死亡率、成功率。由统计结果可以看出，在不同灭菌时间里，地枫皮的茎段、顶芽的污染率、死亡率均有差异，其中顶芽灭菌8 min时效果最好，污染率仅为20%，死亡率为0；而茎段的灭菌时间以10 min效果最好，污染率为30%，无死亡（表1、表2）。

2.2初代诱导培养基筛选

外植体培养10～15 d时，顶芽、腋芽开始萌动，长出小芽（萌芽情况见图1、图2）。A3培养基中的萌芽率最高，顶芽诱导为100%，茎段诱导率达到90%；因此，初代诱导最佳培养基为1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA（表3）。

将初代培养中诱导出来的芽接入附加1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA的MS、B5、N68、VW、N6、ER培养基中培养。由于不同基本培养基中元素的种类和浓度均有所不同，培养 30 d 时，在不同培养基中芽的长势、芽数均有很大区别，其中MS培养基中的芽壮且数目较多，而在VW培养基中的芽细且数量少。不同培养基中芽的长势从壮到弱顺序为：MS>ER>B5>N6>N68>VW。

2.3植物生长调节剂对地枫皮继代增殖的影响

将初代诱导得到的健壮单芽接入附加6-BA、KT、ZT、NAA浓度组合的MS培养基上培养，12 d后形成丛生芽，30 d后统计各培养基中的芽数、增殖系数，观察芽的长势。从表4可以看出，培养基B2对地枫皮增殖作用比较好，增殖系数为3.2。因此，地枫皮继代增殖最佳培养基为2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/LKT+0.3 mg/L NAA。

2.4生长素对地枫皮组培苗生根的影响

地枫皮增殖芽长至2～3 cm高时，切分成单芽，接入C1、C2、C3处理3种生根培养基中培养，在C1处理培养基中无菌芽基部膨大，形成大量愈伤组织；在C2、C3处理培养基中均长根，但根的粗细和数量有所不同。其中在C2处理培养基中无菌芽的根数较少，为5～10条，根较细；在C3处理培养基中的无菌芽根数较多，为10～20条，粗细适中（图3）。因此，地枫皮无菌芽生根较好的培养基为：1/2MS+1.0 mg/L IAA（表5）。

2.5炼苗移栽

地枫皮组培苗长至3～4 cm高时，根据地枫皮的生长特性在温室内将已生根的试管苗炼苗3 d，洗净试管苗根部的培养基，移栽到灭过菌的沙子中，成活率为70%。

3结论与讨论

自1937年White建立第1个植物组织培养基以来，许多研究者报道了各种培养基，其数量多，配方各异。基本培养基

表5植物生长调节剂对地枫皮生根培养的影响

培养基编号接种数

（个）生根数

（条）生根率

（%）生长情况C11000基部膨大，大量愈伤组织C21010100根细，根系少C31010100根粗细适中，根系多

的筛选对植物组织培养有着重要的影响。随着组织培养技术飞速发展，根据植物种类和部位的不同要求，研制出的基本培养基多达685种[9]。由于同一科属植物生长习性相近，其所用的基本培养基也相似。地枫皮原生境为岩溶石山山顶，生长的土壤为黑色石灰土，土壤含有较高的交换性钙和有机质[10]，本试验研究表明，地枫皮组织培养最适的基本培养基为MS，MS具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养，非常适合地枫皮生长，与其同科属八角组织培养的基本培养基相同[11]。

在植物组培快速繁殖技术研究中，为了提高增殖系数，缩短培育时间，便于大规模生产种苗，在其基本培养基中附加不同种类、浓度的激素，以满足不同培养阶段需求。在继代增殖阶段，许多研究已经表明细胞分裂素可以促进丛生芽的增殖[12-13]，本试验以6-BA、ZT、KT与NAA联合配比使用，发现MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+0.3 mg/L NAA诱导效果较好，芽长势好、叶色翠绿。在生根阶段，生长素类物质对植物生根具有促进作用，本试验以NAA、IBA、IAA 3种生长素与6-BA配比使用，研究不同生长素对地枫皮无菌苗生根诱导的影响。结果表明IAA对地枫皮无菌芽生根诱导优于IBA，NAA可以诱导地枫皮无菌芽产生愈伤组织，但对生根诱导作用甚微。 NAA是一种广谱的植物生长调节剂，具有促进细胞分裂、诱导不定根形成的作用[14]，但是在培养过程中也经常出现致使材料老化、形成愈伤组织[15]的现象；而IBA、IAA则是植物自身能够形成的内源生长素，能促进细胞分裂与生长，诱导形成不定根[16-21]。

综上所述，在地枫皮组培快繁技术研究中，地枫皮的茎段、顶芽均可作为组织培养的外植体，MS为较适合的基本培养基，初代诱导较好的培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；最佳继代增殖培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+0.3 mg/L NAA，增殖系数为3.2；最佳生根培养基为：1/2MS+1.0 mg/L IAA。本研究为地枫皮种苗繁育打下良好的基础，也为地枫皮良种选育提供技术平台。

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