利用染色体片段代换系定位水稻HL型育性恢复基因

张宏根等

摘要：以水稻9311为背景、日本晴为供体构建的一套染色体片段代换系为试验材料，利用HL型籼稻不育系粤泰A与代换系测交，根据测交F1群体的花粉育性和小穗育性，结合Bin-map，采用多元回归的方法，对HL型粤泰A的育性恢复QTL进行分析。以花粉育性为指标检测到3个QTLs，分别位于第2、6和10染色体上，定位区段大小为 379 262、1 853 725、1 229 303 bp；以自然小穗育性为指标检测到3个QTLs，分别位于第1、第3和第11染色体上，定位区段大小为455 070、525 340、247 226 bp。

关键词：水稻；染色体片段代换系；恢复基因；基因定位

中图分类号： S511.01文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0064-04

收稿日期：2014-09-06

基金项目：国家“973”计划（编号：2011CB100101）；国家自然科学基金（编号：31071384）；江苏省高校自然科学研究项目（编号：13KJ13210008）；江苏高校优势学科建设工程资助项目。

作者简介：张宏根（1981—），男，江苏南通人，博士，讲师，研究方向为作物遗传育种。E-mail：zhg@yzu.edu.cn。

通信作者：汤述翥，教授，研究方向为作物遗传育种。E-mail：sztang@yzu.edu.cn。〖FL（2K2]目前，我国主要有9种胞质不育系类型用于生产，以野败（WA）型、红莲（HL）型和包台（BT）型为3种代表类型[1]。WA型不育系败育彻底、不育性稳定，在杂交籼稻生产利用中占据主导地位。近年来，HL型不育系在杂交籼稻中应用越来越广泛。杂交粳稻以利用BT型不育系为主，推广面积较小。要发展三系杂交稻，HL型杂交籼稻在生产上进一步的利用是一条重要途径。HL型不育系的恢复谱较广，但强恢复系很少，恢复系选育是限制HL型杂交籼稻进一步发展的重要因素。

质核互作雄性不育系的育性恢复是一复杂的遗传性状，并且环境对目标性状表型的影响较大。已有的研究表明，HL型不育系花粉表现为圆败，其育性恢复由主效基因与微效基因共同控制，且基因间可能存在互作[2-4]。目前，在籼稻核背景下，HL型不育系的主效育性恢复基因已被定位[5-9]，而微效基因的定位及基因效应研究相对较少[10]。因此，有效地开展HL型不育系微效基因的定位是选育HL型强恢复系的关键。

如何对微效恢复基因进行定位是育性恢复遗传研究的难点。染色体片段代换系与受体亲本的遗传背景基本一致，其与受体亲本之间以及系与系之间只有单个或少数的染色体片段的差异，因此其表现出的任何差异都可以直接与导入的片段或被替换的片段联系起来，是进行QTL分析及精细定位目标QTL的理想材料。目前，在水稻中已经有很多的学者利用染色体片段代换系来定位重要性状的QTL[11-16]。为定位HL型籼稻不育系的微效恢复基因，本试验在已有研究基础上以水稻9311为背景、日本晴为供体构建的一套染色体片段代换系为试验材料（利用高通量测序对每一个系基因组进行了重新测序，每个系中的代换片段长度及位置均准确获知），其中9311为HL型强恢复系，日本晴为HL型不育系的保持系，利用HL型籼稻不育系粤泰A与代换系测交，根据测交F1群体的花粉育性和小穗育性，结合Bin-map，采用多元回归的方法，对HL型不育系育性恢复的QTL进行分析，相关研究结果有助于HL型恢复系的选育。

1材料与方法

1.1供试材料

以粳稻测序品种日本晴为供体，籼稻测序品种9311为受体构建的128个染色体片段代换系（C1-C128），9311及HL型籼稻不育系粤泰A。

1.2群体配置

2010年正季在扬州种植亲本9311、HL型粤泰A及128个CSSLs，并配制F1：HL型粤泰A/128CSSLs。成熟时实际收到119个测交F1组合的种子。

2011年春季在海南种植亲本9311、HL型粤泰A、128个CSSLs以及2010年正季获得的各F1，并继续配制HL型粤泰A/128CSSLs。成熟时收获各F1种子。

2011年正季在扬州种植各亲本以及海南收获的各测交F1，每份材料各种植10苗。由于2011年海南春季温度偏低，配制的一些杂交组合未能收到杂交种，以及播种后一些杂交种没有成苗或后期因病枯死而缺苗，最终在配制测交群体中实际得到的测交系数目为116个。

1.3抽穗期调查

抽穗后及时记载抽穗期（50%的稻穗抽穗），并折算成播种至抽穗的天数表示。

1.4花粉育性鉴定与小穗育性鉴定

每天07：00—09：00，在田间每个测交系中选取4株单株，从每个始花植株上选取1个已抽出约1/3的主穗或较大分蘖穗。镜检时，在每个穗子的中上部枝梗中，选取3朵当天要开放的颖花，用1%I2-KI液染色、压片，在低倍显微镜下观察花粉育性。根据花粉粒的形状和对I2-KI液的染色反应，将花粉划分为典败、圆败、染败和正常4种类型。观察时，选择分布均匀、花粉数目超过100粒的视野，分别记录4类花粉的数目，计算4类花粉的百分率。

在抽穗期间，每天07：00—09：00，选取尚未开花的小穗套袋，自交袋大小为50 cm×20 cm，每系2个袋子，每个袋子2个小穗。20 d后，剔除折断或自交袋破损的穗子，调查群体单株的自交小穗育性。

待种子成熟后，每测交系选取4个主茎穗考察自然小穗育性。

1.5水稻DNA提取与分子标记分析

水稻基因组DNA的提取采用CTAB法[17]。普通PCR采用20 μL的反应体系：模板DNA 1.0 μL，10×PCR缓冲液2.0 μL，25 mmol/L MgCl2 2.0 μL，2 mmol/L dNTP 2.0 μL，03 μmol/L引物2.0 μL，Taq酶0.5 U，加ddH2O补足20 μL。富含GC含量模板的20 μL反应体系包括：DNA，2×GCI缓冲液10 μL，2.5 μmol/L的dNTP 3.2 μL，0.3 μmol/L的引物20 μL，Taq酶0.5 U，加ddH2O补足20 μL。PCR扩增条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，55 ℃退火50 s（温度因引物不同而异），72 ℃延伸50 s（不同长度的预期产物按 1 kb/min 调整延伸时间），扩增32个循环；72 ℃延伸10 min，18 ℃保温。PCR反应产物首先在3%琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后在UVP Bioimaging Systems凝胶成像仪上成像。