超高效液相色谱-串联质谱法测定人血浆中氯苯那敏

粟 燕， 陈振玲

(1.凯里学院，贵州凯里 556011；2.中国民用航空局民用航空医学中心，北京 100123；3.民航总医院，北京 100123)

氯苯那敏是第一代抗组胺药物，它可以通过人体血脑屏障进入大脑，与脑部组织胺H1受体结合，产生镇静作用，具体表现为嗜睡、困倦、反应迟钝等[1 - 3]。其说明书中明确规定驾驶人员工作期间禁用。国际民用航空公约附件13《航空器事故和事故征候调查》和《航空器事故和事故征候调查手册》航空医学调查规定，对飞行机组人员的药物使用情况进行调查，其中包括神经类药物进行检查。目前我国保健品存在非法添加西药的情况，存在飞行人员误服等可能性。因此，有必要建立灵敏、准确测定人血浆中氯苯那敏的检测方法，以配合事故和事故征候的调查。现已建立的血浆中氯苯那敏检测分析方法有高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱法和高效液相色谱-串联质谱法等。但上述方法检出限较高、前处理步骤较为繁琐，无法满足事故或事故征候调查的需要[4 - 6]。

本研究建立了快速测定人体血浆中氯苯那敏的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测方法。该方法操作简便、灵敏度高、重复性好，不仅可以满足民航事故或事故征候调查需要，还可以应用于路面驾驶事故调查以及添加少量氯苯那敏复方制剂药代动力学研究。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Waters XEVO TQ UPLC-MS/MS超高效液相色谱-串联质谱仪(美国，沃特斯公司)：BT25S百万分之一天平(德国，Sartorius公司)；Milli-Q超纯水机(德国，Millipore公司)；SIGMA 3-18K型台式高速冷冻离心机(德国，Sigma公司)。

氯苯那敏对照品溶液：精密称取1.00 mg氯苯那敏对照品(迪马公司，批号1.4)于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为1 000 mg/L的标准储备液。标准工作液由甲醇稀释而成。内标阿托伐他汀对照品溶液：精密称取0.99 mg阿托伐他汀对照品(纯度95.5%，中国药品生物制品检定所，批号100590-200802)于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为945 mg/L的标准储备液。内标工作液由甲醇稀释而成。甲醇(色谱纯，Fisher公司)，乙酸铵(色谱纯，Sigma公司)，甲酸(优级纯，Sigma公司)。

人体血浆由健康自愿者提供。

1.2 样品处理

精密移取200 μL人体血浆于1.5 mL离心管中，加入10 μL氯苯那敏标准工作液，加入内标阿托伐他汀工作液2.0 μL，涡旋混匀60 s。加入甲醇500 μL，涡旋混匀60 s，4 ℃条件下，12 000 r/min离心10 min，取上清液测定。

1.3 超高效液相色谱及质谱条件

色谱条件：Waters ACQUITY UPLC HSS C18色谱柱(150×2.1 mm，1.8 μm)；流动相：(A)5 mmol/L乙酸铵水溶液(0.1%甲酸)，(B)甲醇，梯度洗脱条件为：0～3 min，35%～20%A；3～5 min，20%～10%A；流速为0.2 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：5 μL。

质谱条件：离子源：电喷雾正离子源(ESI+)，离子源温度120 ℃；脱溶剂气温度350 ℃；脱溶剂气流速650 L/h，毛细管电压3.0 kV；多反应监测模式(MRM)检测。

表1 氯苯那敏和阿托伐他汀的质谱分析参数

*Quantitative ion.

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法的选择

实验分别考察了甲醇和乙腈两种沉淀剂。结果表明，采用乙腈沉淀蛋白提取时，血浆样品成团状沉淀，造成氯苯那敏和阿托伐他汀提取不完全，重复性较差；采用甲醇沉淀蛋白提取时，血浆沉淀呈均匀絮状，重复性较好。分别考察了2、2.5、3、4倍的甲醇沉淀剂用量对氯苯那敏和阿托伐他汀响应值的影响，结果表明随着沉淀剂用量的增加，氯苯那敏信号峰逐渐变小。综合考虑峰信号响应值、方法的检出限以及沉淀是否完全，选用2.5倍体积甲醇作为最佳沉淀剂用量。

2.2 质谱条件的优化

根据氯苯那敏和阿托伐他汀在电喷雾电离条件下的电离性质，选择在ESI+离子化模式下进行一级质谱分析，得到两种化合物的准分子离子[M+1]分别为m/z275.3、559.3。利用仪器自动优化功能进一步对两种化合物的准分子离子峰进行二级质谱分析即子离子扫描，分别得到氯苯那敏和阿托伐他汀碎片离子信息，选择合理丢失并且丰度较大的两个碎片离子作为辅助定性离子，并以其中丰度最大的碎片离子作为定量离子，优化质谱参数见表1。

2.3 色谱条件优化

参考文献的色谱条件[4 - 6]，分别以甲醇和乙腈为有机相，并且考虑到血浆样品中含有大量有机化合物，基体复杂，采用梯度洗脱(有机相由65%上升到90%)程序，考察氯苯那敏和阿托伐他汀的出峰情况。结果表明，采用乙腈为有机相时，尝试了多种梯度程序，两种化合物的峰形均较差且拖尾；采用甲醇为有机相时，两种化合物峰形获得很大改善。对于乙腈和甲醇分别为有机相洗脱氯苯那敏和阿托伐他汀色谱峰出现的差别，推测两种化合物在色谱柱洗脱过程中，它们与固定相、流动相及样本本身组分之间的复杂相互作用有关，当乙腈为有机相时洗脱过程中两种化合物在血浆组分影响下与固定相结合比较复杂，随乙腈梯度增大难以迅速脱离固定相，形成拖尾；当甲醇为有机相时洗脱过程中两种化合物在血浆组分影响下与固定相结合比较简单，随甲醇梯度增加迅速脱离固定相随流动相进入检测器。当水相采用0.1%甲酸水溶液时，两种化合物响应值较低，并且重复性较差；水相加入乙酸铵时，两种化合物响应值增加，并且重复性得以改善，说明乙酸铵可以促进两种化合物的电离。选用乙酸铵浓度分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mmol/L，优化乙酸铵用量，结果表明随着乙酸铵浓度增加两种化合物响应值逐渐增大，浓度达到5.0 mmol/L时响应值不再增加，因此选择乙酸铵用量5.0 mmol/L。在上述色谱质谱条件下，血浆样品色谱分离良好，内源性物质不干扰氯苯那敏和阿托伐他汀的测定，见图1和图2。

图1 氯苯那敏色谱图(下图：空白血浆;上图：空白血浆+氯苯那敏)Fig.1 The chromatograms of Chlortrimeton (a) Blank plasma+Chlortrimeton;(b) Blank plasma.

图2 内标阿托伐他汀色谱图(下图：空白色浆；上图：空白色浆+阿托伐他汀)Fig.2 The chromatograms of Atorvastatin(ISTD) (a) Blank plasma+Atorvastatin;(b) Blank plasma.

2.4 基质效应、检出限、定量限及线性范围

首先考察基质效应，取200 μL空白血浆，精密加入氯苯那敏系列对照品溶液10 μL和内标阿托伐他汀工作液2.0 μL，配制成氯苯那敏浓度为0.5、20.0、40.0 μg/L的系列标准血浆样品各5份，按照1.2节方法处理并进行分析；同法分别用水代替血浆，按照上述方法处理。以每一种浓度的两种不同处理方法分析得到的峰面积比值计算基质效应，内标阿托伐他汀的基质效应值为102.1%±4.6%，表明阿托伐他汀无明显的基质效应。表2数据表明，血浆对氯苯那敏基质效应不显著。

表2 血浆中氯苯那敏的基质效应考察

以3倍信噪比(S/N)作为检出限，以10倍S/N作为定量限，经过不断稀释样品并分析检测，血浆样品中氯苯那敏的检出限为0.05 μg/L，定量限为0.1 μg/L。

取200 μL空白血浆，加入氯苯那敏对照品，配制0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0和50.0 μg/L系列标准溶液，加入内标阿托伐他汀工作液后，按照1.2节方法沉淀提取，进行色谱质谱分析，记录氯苯那敏和阿托伐他汀峰面积，以氯苯那敏和阿托伐他汀峰面积比值(Y)对氯苯那敏质量浓度(X)进行线性回归，血浆样品中氯苯那敏标准曲线回归方程为：Y=0.0772X-0.0023(r=0.9995)，线性范围为0.1～50.0 μg/L。

2.5 回收率、精密度及稳定性

分别取含有氯苯那敏0.5、20.0和40.0 μg/L的标准血浆样品，加入内标阿托伐他汀工作液2.0 μL，按照1.2节方法沉淀提取，测得氯苯那敏和阿托伐他汀的峰面积比，计算血浆中氯苯那敏的加入回收率，结果如表3所示。分别取含有氯苯那敏的低、中、高三种不同质量浓度的标准血浆样品，加入阿托伐他汀内标工作液，分别测定5次，计算精密度(RSD)。表3结果表明，血浆测定的日内及日间RSD小于10%(n=5)，满足药物动力学研究要求。

表3 血浆中氯苯那敏的添加回收率及日内、日间精密度(n=5)

考察了氯苯那敏在不同储存条件下的稳定性。配制含有氯苯那敏的低、中、高三种不同质量浓度的标准血浆样品，分别于室温24 ℃放置8 h，于-20 ℃冰箱放置30 d，于-20 ℃冰箱冻存并反复冻融3次后处理样品并进行检测，考察其室温稳定性、冻存稳定性和冻融稳定性(n=5)；另考察经过处理的质控样品放在仪器自动进样室10 ℃、12 h后的稳定性(n=5)。结果表明测定值的变异系数均小于15%，表明氯苯那敏的血浆样品在室温24 ℃放置8 h、-20 ℃冰箱放置30 d、反复冻融3次情况下，仍保持稳定；处理后待检的样品在仪器自动进样室10 ℃、12 h内保持稳定。

3 结论

建立了人血浆中氯苯那敏的UPLC-MS/MS测定方法。该方法快速、准确、操作简单、选择性好、灵敏度高，可为可疑氯苯那敏药物相关的民用航空器事故或事故征候调查提供灵敏可靠的检测方法，并且可以用于路面驾驶事故调查及添加少量氯苯那敏复方制剂中氯苯那敏药代动力学研究。